本研究用奶牛β-酪蛋白基因调控序列和人组织型纤溶酶原激活剂指形区缺失体(t-PA指形区缺失体)表达序列，构建了乳腺特异性表达载体pBC1-TPA和pBC2-TPA。在这两个载体中，插入人α1-抗胰蛋白酶核基质附着区(α1-AT MAR)序列，构建成另外两个乳腺特异性表达载体pBCHM1-TPA和pBCHM2-TPA。四个载体转染小鼠乳腺上皮细胞后，发现t-PA指形区缺失体表达良好，转染pBCHM2-TPA的细胞表达效果最显著。pBCHM2-TPA转染牛胎儿成纤维细胞后，筛选稳定克隆株，通过体细胞核移植生产转基因牛克隆胚，用于研制乳腺生物反应器。相关结果如下：1．核基质附着区是一种真核生物的DNA元件，能调控染色体结构和活性。为研究体内MAR相关的染色质准入和转录调控。本研究利用PCR技术扩增人α1-AT MAR序列，全长1252 bp。序列分析表明，所克隆的片段与GenBank中登录的牛乳腺核基质附着区的同源性为99％，通过在线软件进行功能分析，证明该片段含有AT-RichnessPattern，ORI Pattern，ATC Rule等重要功能区。将该序列定向克隆至pEGFP-C1载体中，构成重组载体pME。用pME载体和pEGFP-C1转染人胚肾293T细胞后，经G418抗性筛选得到稳定克隆。半定量RT-PCR及荧光显微镜观察显示此MAR能够增强临近基因的表达。进一步用染色质免疫共沉淀(ChIP)共定位CMV启动子和RNA聚合酶Ⅱ(RNAPⅡ)，PCR结果显示存在MAR元件时，更多的RNA聚合酶Ⅱ被富集到启动子区。表明α1-AT MAR可明显提高基因的表达效率。2．利用PCR技术分三段克隆了牛β-酪蛋白基因，全长约9.7 kb，克隆产物分别插入pGEM-T easy Vector。经NCBI Blastn分析，与牛β-酪蛋白基因相应区段的同源性为98％以上。这三段序列包含完整的5′侧翼序列、前八个外显子及第八个内含子的部分序列。以此构建了两个乳腺特异性表达载体：利用第一段和第二段共有的酶切位点将两段融合，作为5′调控区(6.8 kb)，第三段和实验室已有的600 bp的加尾信号通过重组PCR拼接作为3′调控区(3.4 kb)构建了一乳腺特异性表达载体pBC2；以第一段作为5′调控区，实验室已有的600 bp加尾信号作为3′调控区构建了乳腺特异性表达载体pBC1。3．采用双酶切定向克隆的方法，将人t-PA指形区缺失体表达必需序列插入初级乳腺表达载体，构建了含有抗性基因、报告基因的人t-PA指形区缺失体乳腺表达载体pBC1-TPA和pBC2-TPA。然后插入α1-AT MAR，构成载体pBCHM1-TPA和pBCHM2-TPA。四种载体经脂质体法转染小鼠乳腺上皮细胞后，通过荧光显微镜初步观察到了报告基因绿色荧光蛋白的表达。Western-blot检测发现t-PA指形区缺失体表达良好，pBCHM2-TPA转染组的效果最为理想。4．将乳腺特异性表达载体pBCHM2-TPA转染牛胎儿成纤维细胞后，经G418筛选后，获得稳定克隆。设计特异性引物，RT-PCR稳定的阳性克隆进行鉴定。检测到了t-PA指形区缺失体的表达，PCR和Southern-blot结果表明，t-PA指形区缺失体已稳定整合到阳性细胞的基因组中。阳性细胞在体外培养传代至第10代其生长仍正常，从而建立了转染人t-PA指形区缺失体成纤维细胞系，可用于体细胞核移植。5．以转t-PA基因的牛成纤维细胞为核供体细胞，以牛卵母细胞为受体细胞进行了核移植，通过体视显微镜观察和分析重构卵电融合率，利用倒置显微镜和荧光显微镜观察重构胚胎的生长和发育情况以及t-PA基因在重构胚胎中的表达情况。结果表明：经基因转染和G418筛选后的牛转基因成纤维细胞相对于正常培养成纤维细胞，其细胞内部由于添加了外源基因而发生了一定改变，高浓度的G418筛选导致细胞膜细微结构发生变化，必须在较高电压情况下才能与卵母细胞融合。本实验借助绿色荧光蛋白这一标记基因，对体外培养的转基因克隆胚胎绿色荧光蛋白的表达情况进行观察，结果表明，大部分重组胚发育到8～16细胞以后的时期，绿色荧光蛋白才开始逐渐的表达，并随胚胎体外发育时间的延长，绿色荧光蛋白的表达也逐渐增强。证明利用体细胞介导外源基因的方法来生产转基因牛胚胎的技术路线是可行的。