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热休克蛋白HSPA5(Heat Shock Protein A5,HSPA5)是热休克蛋白 HSP70(Heat Shock Protein 70,HSP70)家族成员之一,具有促进蛋白质的正确折叠、保持内质网的稳定进而维持细胞的稳态等功能。但近来研究发现,异常表达的HSPA5和肿瘤的发生、进展、转移和耐药高度相关。而靶向HSPA5的化合物、多肽与抗体对能够抑制肿瘤细胞生长,其中针对HSPA5开发的抗体药物在体外、体内实验中均发现了特异性抑制肿瘤的能力,并且在临床试验中初见成效。此外在检索肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-relatedapoptosis-inducing 1igand,TRAIL)相关的文献时,发现内质网应激与热休克蛋白过表达是其可能的耐药原因。综上所述,我们可以推测,制备HSPA5的抗体可用来进一步探究HSPA5在肿瘤耐药中的作用,并提供一种可能的用药策略。据此,本论文基于基因表达综合(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库对其中编号为GSE55859的数据集进行一系列生物信息学的分析,包括差异基因、基因本体(Gene Oncology,GO)富集、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集注释、蛋白互作网络(protein-protein interaction,PPI)分析等,最后推测出此芯片数据中 HSPA5 可能是NCI-H460细胞参与TRAIL的耐药过程的关键基因。后续使用Expasy等数据库对HSPA5蛋白部分性质进行预测,由此提出抗原表达与制备策略。利用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术,扩增出两种HSPA5编码基因;接着采用DNA重组技术,将上述编码基因分别装入pET-28a与pGEX-6pl两个载体中,成功构建了两个HSPA5表达载体:BL21/pET28a-HSPA5和BL21/pGEX-6pl-HSPA5,经菌落PCR、双酶切验证正确,测序鉴定序列无误后,使用异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl p-D-Thiogalactoside,IPTG)诱导 His-HSPA5 与 GST-HSPA5两种融合蛋白表达,并优化了 IPTG诱导浓度、诱导温度、诱导时间三个条件,进一步提高了蛋白表达效率;然后使用溶菌酶消化、超声破碎、硫酸铵沉淀、亲和层析技术分离纯化两种融合蛋白。后续使用聚氰基丙烯酸正丁酯(Butyleyanoacrylate,BCA)法、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、Western-Blot对两种目的蛋白进行分子量、纯度、浓度以及免疫性质的鉴定,两种目的蛋白分子量均符合理论值,纯度大于90%,浓度满足后续实验需求,并保留有HSPA5的抗原性。之后,以His-HSPA5融合蛋白为抗原,辅以弗氏佐剂免疫新西兰兔三次,得到具有1:10-5滴度的HSPA5抗血清。通过对抗血清进行protein A亲和纯化,获得HSPA5多克隆抗体,经过SDS-PAGE凝胶电泳、酶联免疫吸附反应(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)、Western-Blot鉴定抗体的纯度、滴度与特异性,结果为该抗体纯度大于95%,滴度为1:10-4,特异性良好。通过对比市售HSPA5抗体,发现HSPA5多克隆抗体在Western Blot应用与市售HSPA5抗体无明显差异。最后,通过细胞计数试剂-8(Cellcoutingkit-8,CCK-8)实验对HSPA5多克隆抗体在NCI-H460细胞中的活性进行检测,发现单独应用HSPA5可抑制NCI-H460细胞的生长,并在联用TRAIL的检测中可降低简易抵抗模型的NCI-H460细胞对TRAIL的抵抗性,具有一定的应用价值。通过生物信息学数据分析,本论文推测HSPA5在NCI-H46细胞对TRAIL的耐药过程中起重要作用。后续建立了两种HSPA5可溶性表达体系,并通过免疫新西兰兔获得大量HSPA5多克隆抗体。本论文的研究验证了HSPA5参与NCI-H460细胞中TRAIL的抵抗,并证明联用HSPA5抗体可降低NCI-H460细胞对TRAIL的抵抗性,为HSPA5作为耐药基因的后续研究打下了重要的理论基础并提供了不可或缺的实验材料。