背景和目的:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是消化系统中常见的恶性肿瘤,全球发病率第3位,且死亡率排第4位,具有高发病率、高死亡率的特征,在我国,结直肠癌现已成为死亡率最高的三大消化系统肿瘤之一。早期结直肠癌症状隐匿,容易误诊、漏诊。目前主要治疗手段为内镜下切除、外科手术、新辅助化疗、辅助化疗、放疗、靶向治疗等。肿瘤的治疗是最大化杀死肿瘤细胞,减少肿瘤细胞数量,进而改善患者总生存期(overall survival,OS)、无进展生存期(progression-free survival,PFS)和改善患者预后。然而,目前结直肠癌治疗现状不容乐观,存在高复发率、高转移率、高耐药率的特点。所以寻找与结直肠癌预后评判相关的分子标志物,以及挖掘肿瘤分子标志物为基础的诊断和治疗靶标,定会具有基础理论意义及重要的临床指导价值。尽管许多研究已经发现多种因素在结直肠癌发病过程中发挥作用,包括编码蛋白质的基因和非编码蛋白质的基因,但结直肠癌的发生与演变是一个错综复杂的调控过程,目前依然有众多未知因素需要进一步研究。长链非编码 RNA(Long non coding RNA,LncRNA)是非编码 RNA(non coding RNA,ncRNA)的一种,其长度大于为200个核苷酸。LncRNA在人体基因内的分布非常广泛,虽然LncRNA并不具有编码蛋白质的潜力,但是它可参与构成复杂的基因表达调控网络,调节各种生物学过程。近来研究结果显示LncRNA可在干细胞的生长、分化、凋亡中发挥着重要作用。此外,LncRNA参与控制多种分子途径,引起基因表达改变,最终调控细胞增殖、凋亡和迁移,LncRNA在细胞周期调控、表观遗传学调控、转录调控和转录后调控等生物学过程中发挥着重要作用,尤其是在恶性肿瘤的发生、发展过程中扮演着重要角色。同样地,目前研究表明LncRNA在结直肠癌的发生发展中也发挥着重要作用。LncRNA-ENST00000464452 是 LncRNA PANK2(pantothenate kinase 2)的一种剪切变异体,定位于 Chromosome chr 20:4151129-4153322(+),长度为 2194 bp,包括一个外显子。目前关于LncRNA PANK2的报道非常少,仅有相关生物信息学数据库提示LncRNA PANK2可在大肠、食管、胆囊、肺、卵巢、甲状腺中表达,LncRNA PANK2可在结肠腺癌、胃癌、肺腺癌组织中异常表达,并与DNA甲基化水平密切相关,提示LncRNAPANK2在肿瘤的发展进程中可能扮演了重要角色。因此本研究首次综合分析了 LncRNA PANK2在结直肠癌中表达和生物学作用,并初步探讨了其对肿瘤调节作用的分子机制。本研究内容包括三部分:第一部分为结直肠癌不同组织中LncRNA PANK2表达水平与临床病理特征的相关性分析;第二部分为调控LncRNA PANK2表达对结直肠癌细胞系增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响;第三部分为LncRNA PANK2高表达竞争性结合microRNA-19a-3p,提高SOX4表达,促进结直肠癌转移。第一部分结直肠癌组织中LncRNA PANK2异常表达与临床病理相关性目的:探讨LncRNA PANK2在结直肠癌患者癌组织、切缘组织、周围淋巴结组织中的表达变化与临床病理特征的相关性方法:1.回顾性分析39例行手术切除治疗的结直肠癌患者临床资料,收集结直肠癌患者的癌组织、切缘组织、周围淋巴结组织标本。2.采用实时荧光定量PCR检测癌组织、切缘组织、周围淋巴结组织中LncRNA PANK2的表达量。3.统计学分析LncRNA PANK2的表达与患者临床病理特征的相关性。结果:1.共纳入39例患者,年龄范围42-88岁,平均65.90±10.34岁,无淋巴结转移患者24例,有淋巴结转移15例。有淋巴结转移和无淋巴结转移患者的年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤体积、浸润深度及分化程度之间无统计学差异。2.不同部位组织LncRNA PANK2表达量比较显示:LncRNA PANK2表达量切缘为(0.97±0.46),癌组织为(1.25±0.53),淋巴结为(1.70±0.52)。癌组织LncRNAPANK2表达量明显高于切缘组织(P<0.05),淋巴结LncRNA PANK2表达量明显高于癌组织(P<0.001)和切缘组织(P<0.001)。3.有淋巴结转移患者的切缘组织、癌组织及淋巴结LncRNA PANK2表达量明显高于无淋巴结转移患者(P=0.008、0.003、0.015)。结论:LncRNAPANK2过表达与结直肠癌的转移密切相关。第二部分调控LncRNAPANK2的表达对结直肠癌细胞系增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响目的:探讨下调LncRNAPANK2的表达对结直肠癌细胞系HCT 116增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响方法:1.制备下调LncRNA PANK2表达的重组慢病毒载体,感染对数生长期的HCT 116细胞,得到沉默LncRNAPANK2表达的HCT 116细胞株。2.MTT实验检测沉默LncRNAPANK2对HCT 116细胞增殖能力的影响。3.FACS凋亡实验检测沉默LncRNAPANK2对HCT 116细胞凋亡能力的影响。4.Transwell实验检测沉默LncRNAPANK2对HCT 116细胞迁移能力的影响。5.细胞侵袭小室实验检测沉默LncRNAPANK2对HCT 116细胞侵袭能力的影响。结果:1.成功构建LVpFU-LncRNA PANK2载体,测序与BLAST结果显示完全吻合;RT-qPCR结果显示:与对照组相比,转染LncRNAPANK2 KD2组的HCT 116细胞中LncRNA PANK2表达水平显著下调(P<0.05),得到沉默LncRNA PANK2表达的HCT 116细胞株。2.MTT实验结果显示:与对照组相比,转染后第3天,转染LncRNAPANK2 KD2组HCT 116细胞生长(OD 490和OD 490/fold)出现明显抑制(P<0.05),并且随时间的延长而日益显著。3.FACS凋亡实验检测结果显示:与对照组(3.47±0.17%)相比,LncRNA PANK2 KD2组凋亡细胞率(4.05±0.11%)显著升高(P<0.05),表明沉默LncRNA PANK2细胞可以促进细胞凋亡。4.Transwell实验结果显示:与对照组(256±8.23)相比,LncRNA PANK2 KD2组跨膜细胞倍数(9± 1.76)显著下降(P<0.05),表明沉默LncRNA PANK2细胞迁移受到显著抑制。5.细胞侵袭小室实验结果显示:与对照组(248±4.44)相比,LncRNA PANK2 KD2组侵袭细胞数(76±11.61)显著下降(P<0.05),与对照组(1.00±0.02)相比,LncRNAPANK2 KD2组侵袭细胞相对倍数(0.31±0.05)显著下降(P<0.05),表明沉默LncRNAPANK2细胞侵袭受到显著抑制。结论:体外沉默LncRNAPANK2表达,可有效抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,促进细胞凋亡。第三部分:LncRNA PANK2高表达竞争性结合microRNA-19a-3p,提高SOX4表达,促进结直肠癌转移目的:分析并验证microRNA-19a-3p为LncRNAPANK2的作用靶基因,同时预测了该信号通路最终靶向蛋白靶标—SOX4以及其发挥生物功能效应的作用机制。方法:1.生物信息学技术筛选LncRNA PANK2候选靶基因以及进行作用验证。2.结合基因比对、定位分析、生物信息预测,推测SOX4为最终蛋白效应靶点。3.qRT-PCR结合数据库分析SOX4与结直肠癌发生、发展的相关性。4.构建SOX4的敲减细胞株,并通过MTT实验、FACS凋亡检测、划痕检测、以及相关信号通路检测并探索SOX4的生物学活性。结果:1.生物信息学筛选出microRNA-19a-3p为LncRNA PANK2结合靶基因。2.通过荧光素酶报告系统检测,结合RT-PCR检测敲减和过表达LncRNA PANK2的细胞系,发现LncRNA PANK2与microRNA-19a-3p的表达呈负向调控关系,同时在结直肠癌不同组织中表达具有明显差异性,这些结果均提示:microRNA-19a-3p为LncRNA PANK2直接调控的靶基因。3.使用TargetScan以及miRTarBase进行数据库靶标预测—SOX4为最终效应蛋白靶点。4.基于预测结果,我们分别分析了 SOX4在结直肠癌不同组织中的表达与预后相关性;同时采用Pearson相关分析发现SOX4与microRNA-19a-3p呈显著负相关。5.成功构建SOX4的敲减细胞系,细胞活力检测发现HCT 116细胞的生长曲线伴随SOX4的下调有所降低;同时采用流式检测发现细胞凋亡明显增高,迁移能力检测中发现敲减后细胞迁移能力下降,侵袭能力检测中发现侵袭能力下降;最后采用Western-Blot检测SOX4下调后,与SOX4结合相互作用蛋白c-Myc显著下调,同时与迁移相关通路上的多种效应蛋白出现显著改变,以上结果均提示:降低SOX4的表达消弱了大肠癌细胞的生物学活性。6.结直肠癌中LncRNAPANK2高表达竞争性结合microRNA-19a-3p,提高SOX4表达,促进细胞转移能力。结论:体外沉默SOX4表达,可有效抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,促进凋亡能力。本课题组前期通过全基因组测序结果,筛选出新型LncRNA PANK2为结直肠癌中的显著差异表达基因。本研究针对该基因进行了深入探讨,研究内容主要分为以下三部分:首先,在结直肠癌患者的癌组织、切缘组织以及淋巴结组织中进行了 LncRNA PANK2表达量比较,结果发现LncRNA PANK2在结直肠癌组织的表达明显高于切缘组织,在淋巴结组织的表达明显高于癌组织和切缘组织;有淋巴结转移患者的癌组织、切缘组织及淋巴结组织均明显高于无淋巴结转移患者,提示LncRNA PANK2过表达与结直肠癌的转移密切相关;其次,采用基本细胞生物学方法在体外探索了 LncRNA PANK2的生物学活性,结果发现体外沉默LncRNA PANK2后可有效抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,促进其凋亡能力;最后,结合生物信息学,我们进一步探索了 LncRNA PANK2可能吸附的分子海绵以及作用的潜在蛋白靶点,结果发现LncRNA PANK2高表达可竞争性结合microRNA-19a-3p,提高SOX4表达,促进结直肠癌转移。综上,LncRNA PANK2有可能成为结直肠癌转移的预警生物学标志物以及临床治疗的新基因靶点,更好的为临床治疗提供理论依据以及医疗参考。