性逆转过程中黄鳝性腺凋亡信号通路研究

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黄鳝为雌雄同体,雌性先熟的性逆转鱼类,细胞凋亡在雌性生殖细胞退化消失过程中扮演了重要角色。为探究黄鳝性逆转过程中卵母细胞的凋亡机制,本研究检测了不同发育时期黄鳝性腺的细胞凋亡率,分析了凋亡信号通路相关基因和蛋白的表达水平,并定位了凋亡蛋白Cyt-C的表达位置。同时,检测了凋亡相关基因在经H2O2和Z-VAD-FMK处理后黄鳝卵巢组织中的表达情况。主要结果如下:1.流式细胞技术检测结果表明,不同发育时期性腺均能检测到细胞凋亡。细胞凋亡率随性腺由雌性向雄性发育呈现先上升后下降的趋势,间性早期的细胞凋亡率显著高于其它各时期(P<0.05),卵巢和精巢中细胞凋亡率差异不显著(P>0.05)。凋亡相关蛋白酶联免疫吸附法检测结果发现,线粒体通路的Cyt-C、死亡受体通路的Caspase-8和内质网通路的Caspase-12在各个发育时期均有表达。Cyt-C的相对含量明显高于Caspase-12和Caspase-8(P<0.05),在间性早期最高(P<0.05),并随性逆转的发生含量呈下降的趋势。实时定量荧光PCR分析结果表明,3条凋亡信号通路相关基因在不同发育时期性腺中均有表达。线粒体途径中bax的总体表达水平高于死亡受体途径中的tnfr1和内质网途径中的calpain。这些结果表明,线粒体凋亡通路在黄鳝性腺性逆转过程中可能起着重要作用。2.Cyt-C的免疫印迹检测结果显示,各发育时期黄鳝性腺样品中均能检测到符合预期大小的目的条带(12.0 k Da)。免疫组化定位结果表明,在卵黄生成中期性腺中,卵母细胞细胞质均能检测到阳性信号,且初级生长期卵母细胞信号强于皮质小泡期。间性性腺中,各发育时期卵母细胞细胞质中均有阳性信号。这提示我们,Cyt-C参与了黄鳝卵母细胞的凋亡过程。3.体外孵育结果显示,凋亡相关基因在不同浓度H2O2处理条件下总体呈现上升趋势。与其它各处理时间组对比,处理2h后各浓度组的apaf 1表达量最高,而bax的表达在处理4h和8h后达到最高。在不同处理浓度的情况下,apaf1表达在处理2h后达到极大值,bax在处理4h和8h后达到最大值。不同浓度Z-VAD-FMK离体孵育黄鳝卵巢组织后,apaf1、bax、tnfr1和fadd表达量呈现一定的时间和剂量效应。综上,相比较与其它两条通路,线粒体凋亡通路在黄鳝卵母细胞凋亡过程中可能发挥了更为重要的作用,这为后续深入研究黄鳝性逆转机制提供了参考。
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