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目的:获得性免疫缺陷综合征又称之为艾滋病(AIDS)目前已夺走了全世界2500多万人的生命,已然成为危害人类生命的四大杀手之一。近年来,临床常规使用最多的是高效的抗逆转录病毒治疗(HAART),但因其价格昂贵、病人难以承受而导致依从性差、副作用大等,并且不能完全清除病毒。HIV分为:HIV-1和HIV-2,目前主要流行的是HIV-1。所以,研发并设计出安全有效的抗艾滋病病毒1型(HIV-1)疫苗显得尤为迫切。研究发现,CD8~+毒性T细胞(CTL)对于控制HIV-1的复制发挥着重要的作用,当今以CTL为基础研制针对HIV-1疫苗成为热点之一。因此,本文主要研究CTL的抗HIV-1病毒功能,以期能明确CTL的抗病毒作用机制;同时研究CTL、抗体和NK细胞抗病毒的相对贡献以及协同作用,为疫苗研发提供重要信息。我们将从4个方面对其抗病毒机制进行研究:第一,通过体外增殖试验研究影响人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)特异性的CTL增殖反应的因素;第二,应用不同的抗原肽直接刺激HIV-1特异性CTL克隆细胞株以检测其抗病毒功能;第三,比较识别同一抗原表位的不同CTL克隆的抗病毒功能、TCR克隆型、耗竭分子表达、细胞因子分泌以及对不同病毒变异株的抑制能力揭示与CTL抗病毒功能相关的重要分子。第四,进一步研究发现机体抗HIV-1病毒的免疫保护仅仅依靠CTL是不够的,还需NK细胞以及中和抗体的参与,所以应用体外病毒中和实验和病毒抑制实验比较HIV-1感染者体内分离的病毒特异性CTL和自然杀伤细胞(NK)以及中和抗体抑制HIV-1在自体CD4~+T细胞中复制的能力。方法:(1)在体外使用3种不同的抗原肽刺激方式分别刺激HIV-1特异性CTL增殖,在培养体系中比较加入外源性细胞生长因子IL-2后对HIV-1特异性CTL增殖的影响因素。(2)应用HIV-1最优表位短肽刺激外周血单个核细胞(PBMCs)并通过有限稀释法获得12株CTL克隆细胞,然后分别进行多种体外功能实验,包括IFN-γ酶联免疫斑点实验、杀伤活性实验、脱颗粒功能实验。(3)对HIV-1抗原表位B*27 KK10特异性的9个CTL克隆细胞分别进行抗病毒的功能实验:包括IFN-γ酶联免疫斑点实验、细胞毒杀伤实验即铬释放实验以及病毒抑制实验;通过TCR基因测序检测CTL的TCR克隆型;通过病毒抑制实验验证TCR特异性的CTL克隆细胞能否有效抑制X4和R5病毒的野生株及其抗原表位变异毒株;通过PCR和流式细胞分析检测与抗病毒功能相关的分子以及细胞因子。(4)运用抗体中和实验以及病毒抑制实验分别检测中和抗体、CTL以及NK细胞抗病毒的相对贡献以及协同作用。结果:(1)抗原肽直接刺激CTL组以及抗原肽刺激CTL 2小时组,它们刺激增殖的能力相似,而通过去除PBMCs中的CD8~+T细胞的混合APCs呈递组刺激CTL与前两种刺激方式相比,能够更好的刺激CTL增殖。(2)不同的HLA限制性以及HIV-1抗原表位特异性CTL克隆细胞杀伤靶细胞的能力不同且杀伤活性与CTL脱颗粒功能有关。(3)B*27-KK10表位特异性CTL能够有效抑制HIV-1的复制且识别B*27-KK10抗原表位的不同TCR特异性的CTL克隆细胞具有不同的病毒抑制能力;具有高分泌MIP-1β的CTL克隆细胞可显著抑制HIV-1病毒复制;Vβ15 TCR克隆型E501能够同时抑制X4和R5病毒复制且能够交叉识别病毒的野生株和变异株。(4)中和抗体b12可以中和HIV-1对CD4~+T细胞的感染却不能抑制HIV-1在CD4~+T细胞中复制和细胞间传播,而CTL可抑制HIV-1在CD4~+T细胞中的复制;中和抗体b12并不协同CTL抑制HIV-1在CD4~+T细胞中复制但协同NK细胞抑制HIV-1在CD4~+T细胞中复制。结论:(1)在培养体系中不加入IL-2的条件下,使用混合APCs呈递抗原肽刺激方式能够更有效的刺激HIV-1特异性CTL增殖。(2)HIV-1特异性CTL克隆细胞抗病毒的几种功能反应之间具有共同调节的机制。(3)即使识别同一抗原表位的CTL,其抗病毒的能力也不一样,由TCR克隆型决定。(4)HIV-1感染机体后,仅仅依靠CTL来识别杀伤靶细胞是远远不够的,还需要NK细胞和中和抗体的参与。