糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是2型糖尿病(Type2diabetes mellitus, T2DM)患者常见的、严重影响生活质量的慢性并发症,发病率逐年升高,据估测,2030年全世界T2DM患者数量将从2000年的1.71亿增加到3.66亿,其中30%-40%的T2DM将发展为DN,在欧美国家DN是终未期肾病(End-stage renal disease,ESRD)的最常见病因,约占全部ESRD病例的44%。早期诊断DN并干预其发展越来越受到医学界的重视,但DN起病隐袭,早期缺乏明显的临床症状。目前临床上早期诊断DN存在较大困难。。肾活检是早期诊断最可靠的方法,然而,很多患者不愿意接受这种具有创伤性的侵入检查,很多接受检查的患者肾脏组织病理活检并不能找到特征性的病理改变。肾穿刺活检术不能作为T2DM患者检查的常规项目。而尿液富含肾脏病变信息,取材简单、无创伤,可重复取样,目前被广泛认可的糖尿病肾病的早期实验室诊断标准是持续性微量白蛋白尿,已有许多研究发现尿微量白蛋白(Microalbuminuria, MALB)作为DN早期诊断指标的准确性和特异性不高,2型糖尿病患者大多年龄较大,常伴有高血压、冠心病等合并症,微量白蛋白尿也可因这些并发症引起。且在MALB出现时,DN已发展到第Ⅲ期,因而只依靠监测MALB并不能及时准确地对DN做出诊断,会带来较高的误诊和漏诊。因此2型糖尿病肾病的早期诊断迫切需要寻找新的特异性标志物以判断病情,指导治疗,评价疗效。随着蛋白质组学技术的发展,将其与体液技术相结合的尿液蛋白质组学技术为DN早期诊断标志物的筛选提供了技术支持,利用尿液蛋白质组学技术可能发现一些新的DN早期诊断标志物并作为药物疗效评价的指标。本研究通过弱阳离子(weak cation exchange, WCX)磁珠分离系统联合基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF-MS)技术对2型糖尿病患者及模型动物的尿液标本进行比较蛋白组学分析,并对模型动物进行干预研究。本课题研究内容共分为以下三部分。第一部分：2型糖尿病肾病患者尿小分子多肽差异分析；第二部分：2型糖尿病肾病大鼠模型的建立及肾病早期尿小分子多肽差异分析；第三部分：厄贝沙坦干预对糖尿病肾病大鼠尿小分子多肽影响。第一部分：2型糖尿病肾病患者尿小分子多肽差异分析目的：利用弱阳离子磁珠分离系统结合MALDI-TOF-MS的方法获取糖尿病肾病患者的尿小分子多肽谱。方法：按Mogensen标准,68例2型糖尿病患者经测三天平均微量白蛋白尿排泄率(Urinary Albamin Excretion Rate, UAER)后分组,其中正常蛋白尿(A)组24例,微量白蛋白(B)组22例,大量蛋白(C)组22例；健康对照(D)组20例。A及B组肾小球率过滤(glomerular filtration rate,GFR)均>90ml/(min·1.73m2),C组GFR60～89ml/(min·1.73m2)。采用WCX磁珠纯化试剂盒富集尿多肽,再经MALDI-TOF-MS技术,采集尿液多肽谱,应用ClinProtTM软件进行生物学比较分析。结果：质荷比<12000时,A组与D组相比,有15个蛋白质峰差异有统计学意义(P<0.01)。B组与D组相比,有1个蛋白质峰差异有统计学意义(P=0.0298)。C组与D组相比,有10个蛋白质峰差异有统计学意义(P<0.01)。结论：弱阳离子磁珠分离系统联合MALDI-TOF-MS蛋白质检测技术,能够获得健康人及DN患者尿液小分子多肽谱,为进一步从中寻找早期筛查及评价干预效果的标志物提供基础。第二部分：2型糖尿病肾病大鼠模型的建立及肾病早期尿小分子多肽差异分析目的：探寻高糖高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素(Streptozocin, STZ)诱导致2型糖尿病大鼠糖尿病肾病早期尿液小分子差异多肽。方法：①40只4周龄SD (Sprague-Dawley)大鼠随机分为糖尿病模型(A)组30只和对照(B)组10只,A组应用高糖高脂饮食6周联合STZ注射(以注射时计为0),诱导致2型糖尿病大鼠模型,B组正常饮食；②每2周测体质量,尾静脉取血检测血糖；-2、2、12周周末收集各组大鼠24小时尿液、血样本和肾脏标本。尿液测24小时白蛋白排泄率,血样本测胰岛素、胆固醇、甘油三脂等指标,肾脏标本HE染色光镜下观察。③将大鼠尿液分为四组：A1组(-2周末时A组尿液,10个标本)、A2组(12周末时A组尿液,10个标本)；B组(12周末时B组尿液,10个标本)。采用弱阳离子磁珠联合MALDI-TOF-MS技术对各组尿液样本进行尿液多肽谱的采集,应用ClinProTools软件进行生物学比较分析。结果：①高糖高脂饮食6周联合25mg/kg STZ腹腔注射诱导2型糖尿病肾病大鼠模型,成模率87%,成模大鼠具有高血糖、高血脂、胰岛素抵抗等特点,并出现DN相应的形态及功能改变。②弱阳离子磁珠联合MALDI-TOF-MS技术检测三组尿液。ClinProTools软件分析后发现A1和B组间无明显差异。A2组和B组间多肽谱比较发现有7个差异多肽峰具有统计学意义,在A2组表达高表达有4个,低表达的有3个。结论：①利用高糖高脂饮食6周联合小剂量STZ可以成功诱导2型糖尿病肾病大鼠模型。②弱阳离子磁珠联合MALDI-TOF-MS技术,能获得2型糖尿病大鼠糖尿病肾病早期和正常对照大鼠尿液多肽谱,并有效地鉴定出峰度较高的差异峰。第三部分：厄贝沙坦干预对糖尿病肾病大鼠尿小分子多肽影响目的探讨血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)1型受体拮抗剂(Angiotensin receptor blocker, ARB)厄贝沙坦对2型糖尿病大鼠尿小分子多肽的影响。方法①将30只实验大鼠随机分成正常对照组(A组)、糖尿病组(B组)、厄贝沙坦治疗组(C组)。高糖高脂饮食联合小剂量STZ诱导致2型糖尿病大鼠糖尿病肾病早期,以STZ注射时计为0；②C组在造模成功后3天即开始喂服厄贝沙坦[50mg/(kg·d),杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司)],B组则以等体积蒸馏水灌胃。每2周末测体质量、血压,尾静脉取血检测血糖；-2、12周末收集各组大鼠24小时尿液、血样本和肾脏标本。尿液测24小时白蛋白排泄率,血样本测胰岛素、胆固醇、甘油三脂等指标。肾脏标本测肾重后制作病理切片。③将大鼠尿液分为四组：A1组(-2周时A组尿液,8个标本)、A2组(12周时A组尿液,8个标本)、B组(12周时B组尿液,8个标本)和C组(12周时C组尿液,8个标本)。采用弱阳离子磁珠联合MALDI-TOF-MS技术对各组尿液样本进行尿液多肽谱的采集,应用ClinProTools软件进行生物学比较分析。结果：①弱阳离子磁珠联合MALDI-TOF-MS技术检测四组尿液。ClinProTools软件分析后发现A1和A2组间无明显差异。A2组和B组间多肽谱比较发现有7个差异多肽峰具有统计学意义,在B组表达高表达有4个,低表达的有3个。C组和A2组间多肽谱比较发现有5个差异多肽峰具有统计学意义,在C组表达高表达有3个,低表达的有2个。C组和B组间多肽谱比较发现有2个差异多肽峰具有统计学意义,在C组表达高表达有1个,低表达的有1个。②C组12周时肾脏病理结构与同时期B组比较改变轻微。结论：①弱阳离子磁珠联合MALDI-TOF-MS技术,能获得2型糖尿病大鼠糖尿病肾病早期和正常对照大鼠尿液多肽谱,并有效地鉴定出峰度较高的差异峰。②厄贝沙坦早期干预可以明显改善糖尿病肾病大鼠尿液多肽谱的异常。③厄贝沙坦早期干预可以延缓或阻止糖尿病肾病大鼠病理改变进程。