疫苗根据技术特点分为传统疫苗和新型疫苗。多糖结合疫苗则属于新型疫苗的一种。多糖结合疫苗是指采用化学方法将多糖共价结合在蛋白载体上所制备成的多糖-蛋白结合疫苗，用于提高细菌疫苗多糖抗原的免疫原性。国内研制的结合疫苗多采用类毒素，但类毒素作为载体可诱导产生全身及局部免疫反应，具有粘膜佐剂作用，但具有局限性。因为，用福尔马林或戊二醛脱毒的类毒素，会改变其自身的蛋白结构，可能破坏了重要的T细胞抗原位点，会影响其免疫原性。而且，体内存在的类毒素抗体可能影响结合疫苗的免疫应答。故现在研究的最多的蛋白载体是CRM197。　　 CRM197(cross reacting material197)是白喉毒素的一种突变体，它的第52位氨基酸由G1y突变为G1u，致使白喉毒素酶活性位点发生改变，从而不能对细胞产生毒性作用，但在抗原性和免疫原性上仍与天然的白喉毒素保持一致。因此本实验利用基因工程技术在大肠杆菌中对CRM197进行诱导表达，经纯化后，将重组蛋白CRM197作为载体，研究了它与肺炎链球菌荚膜多糖结合的可行性，并对其免疫原性进行了初步研究。　　 首先，根据GenBank中白喉毒素的基因序列(登录号：CQ967258)，进行密码子优化，加强分泌型信号肽，合成基因。同时设计引物，运用PCR技术扩增不含信号肽的CRM197基因。构建两组质粒pBAD-DEST49/CRM197和*pBAD-DEST49/CRM197。双酶切鉴定后，转入大肠杆菌中进行诱导表达。结果显示，分泌型菌株中的重组蛋白CRM197一部分存在于细胞间隙，一部分以包涵体形式存在细胞质内。　　 其次，对表达的蛋白分开纯化。分泌到细胞间隙的蛋白，通过增强细胞壁的通透性，让细胞间隙中的蛋白释放出来。对于包涵体形式的蛋白，破碎菌体离心后取沉淀。经过蛋白质变性复性等一系列步骤后，过DEAE阴离子柱，可使重组蛋白CRM197纯度达到95％以上。通过免疫印迹法验证重组CRM197的活性，结果显示重组蛋白CRM197具有良好的抗原性。　　 最后，用溴化氰活化肺炎链球菌荚膜多糖，以ADH作为连接剂，以重组蛋白CRM197作为蛋白载体，在EDAC的作用下制备肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197结合物。通过免疫双扩散试验证明结合物能分别与肺炎链球菌血清和白喉抗毒素产生沉淀线，说明结合物偶联成功，并具有良好的抗原性。　　 本研究应用基因工程技术获得了能表达重组蛋白CRM917的工程菌菌株，并将纯化后的重组蛋白CRM197与肺炎链球菌荚膜多糖偶联，制成了肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197结合物。为进一步以重组CRM197为载体蛋白，制备其它结合疫苗奠定基础。