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研究背景:
类风湿关节炎(RA)是一种常见的以进行性关节软骨和骨毁损为特征的慢性炎症性自身免疫性疾病,多见于中年女性,在我国的患病率为0.32%~0.36%,临床主要表现为对称性、慢性、进行性多关节炎,造成关节软骨、骨和关节囊破坏,最终导致关节畸形和功能丧失,是造成人群劳动力丧失和致残的主要病因之一。目前RA的病因和发病机制尚未完全阐明,治疗主要采用非甾类抗炎药控制症状及改善病情药(DMARDs)延缓关节破坏的进展。然而,临床上有相当一部分的患者对传统的改善病情药无效,因此寻找治疗RA的新靶点具有重要的意义。
免疫耐受对于维持体内免疫平衡和防止自身免疫性疾病非常重要,其中外周耐受是维持免疫耐受的重要机制。近年来,一种新型免疫抑制性T细胞即调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)正引起人们的重视。CD4+CD25+调节性T细胞的主动抑制作用是引发外周免疫耐受的主要部分。越来越多的研究表明CD4+CD25+Tregs可抑制病理性免疫反应的发生,维持自身免疫耐受,在抑制自身免疫性疾病、肿瘤免疫、移植耐受中具有重要作用。研究发现无论是胸腺来源还是外周诱导的CD4+CD25+Tregs都能特异性地表达Foxp3,具有下调免疫应答的功能,且不受细胞活化的影响。由此认为Foxp3是CD4+CD25+Tregs特异性的标志,并在Tregs的发育和免疫调节功能的发挥过程中具有重要的作用。目前CD4+CD25+Treg细胞在RA中的研究不多,主要集中在外周血和滑液中,研究表明,RA患者外周血及关节局部存在调节性T细胞数量和功能的变化。然而目前尚未有关于RA滑膜局部的调节性T细胞与临床疾病活动性及关节破坏关系的报道。
研究目的:
通过检测Foxp3在RA滑膜的表达,分析Foxp3+Tregs与滑膜炎病理学评分、临床疾病活动性及关节破坏指标的关系,探讨调节性T细胞在RA发病机制中的可能作用,为治疗RA探索新的靶点。
材料与方法:
1.研究对象及标本来源
25例活动期RA患者,诊断均符合1987年美国风湿病学会(ARA)修订的RA分类标准。对照组包括14例骨关节炎(OA)患者,诊断均符合1986年ARA膝OA分类标准。16例非炎性关节病患者,诊断包括半月板或韧带损伤、骨折、无菌性股骨头坏死、滑膜皱襞综合征等并排除RA、OA等炎性关节病。
本课题选用28个关节压痛数(TJC28)、28个关节肿胀数(SJC28)和CRP等三个客观参数计算疾病活动度评分28(Disease active score28,DAS28)。计算公式如下:DAS28=[0.56*sqrt(TJC28)+0.28*sqrt(SJC28)+0.36*ln(CRP+1)]*1.10+1.15(临床意义:轻度活动<3.2,中度活动≥3.2且≤5.1,重度活动>5.1,临床缓解<2.6)
根据DAS28将RA患者分为中度活动组(n=12)和重度活动组(n=13)。
RA组滑膜均取自细针滑膜活检术;OA组及非炎性关节病组滑膜取自关节镜手术、关节置换术或细针滑膜活检术。
2.实验方法
(1)细针滑膜活检方法盲式细针滑膜活检术获取滑膜组织,滑膜组织离体后立即用4℃的10%中性福尔马林固定,24小时后予常规脱水、石蜡包埋。
(2)25例活动期RA滑膜、14例OA和16例非炎性关节病滑膜连续切片、常规HE及Foxp3、CD3、CD20、CD34、CD38、CD68等多种单抗免疫组化染色。
(3)比较两组RA患者Foxp3+Tregs细胞数量以及Foxp3+Tregs/CD3+Tcells百分数,分析Foxp3+Tregs与滑膜炎病理学评分、临床疾病活动性及关节破坏指标的关系。
3.观察指标
(1)病情活动性指标
①临床指标:关节功能分级、28个关节压痛/肿胀指数、晨僵时间、双手平均握力、疼痛VAS评分、HAQ评分、关节炎影响指数(AIMS)。
②血清指标:ESR、C反应蛋白、类风湿因子、抗环瓜氨酸肽抗体。
③疾病活动度:DAS28评分。
(2)放射学关节破坏指标
采用双手Sharp评分法计算双手X线狭窄评分、侵蚀评分和Sharp评分。由实验者和放射科专业人员双盲进行评分。
(3)滑膜病理学评分
将所有滑膜标本进行编号,由实验者和病理学专业人员双盲进行各项病理学分析。只对具有完整衬里层的滑膜(完整滑膜)进行观察,每一份滑膜标本中至少有3个完整滑膜。
①滑膜炎积分:对HE染色的所有完整滑膜根据滑膜衬里层增生情况、炎症浸润程度和滑膜基质活化情况进行滑膜炎积分评分。三种病理学改变按照轻重程度分别进行0~3分半定量评分。将三种分数相加即为滑膜炎积分,范围0~9分。
②炎症细胞的形态学判断:根据HE并结合IHC判断炎症细胞。
⑨细胞定量计数方法:随机选择17个油镜视野,计算每个视野下细胞数,然后求平均值,乘以转换因子0.0625-1得出每平方毫米细胞数(单位:mm—2)。
④半定量评分方法:衬里层CD68阳性细胞百分数的半定量评分方法:无为0分,1%~25%为1分,26%~50%为2分,51%~75%为3分,76%~100%为4分。血管增生程度的半定量评分方法:无血管增生者为0分,轻度为1分,中度为2分,重度为3分。
4.统计学方法
所有数据处理均采用SPSS14.0统计软件包进行统计学处理。计量资料以均数±标准差(-x±s)表示并给出取值范围(range)。服从正态分布且方差齐的两组间均数的比较采用t检验。两个分类变量间的关联分析采用Spearman秩相关分析。检验水准均为0.05。
结果:
1.Foxp3在RA滑膜中的表达
OA和非炎性关节病组滑膜组织中无Foxp3表达。在RA滑膜组织中Foxp3显著表达,Foxp3表达于细胞的胞核。对照同一标本连续切片免疫组化结果,显示Foxp3主要表达于滑膜衬里下层T细胞,其中重度活动组患者滑膜Foxp3+Tregs数量与Foxp3+Tregs/CD3+Tcells百分数均较中度活动组明显减少,两者有统计学差异(P=0.005、0.001)。
2.RA滑膜Foxp3+Tregs与滑膜病理学改变的关系
RA重度活动组患者滑膜炎积分、滑膜衬里层增生程度、衬里层CD68阳性细胞百分数均较中度活动组增高,两者有统计学差异(P=0.012、0.000、0.004)。RA滑膜Foxp3+Tregs的数量与滑膜炎积分、衬里层增生程度、衬里层CD68阳性细胞百分数分别呈负相关(r=—0.622、—0.916、—0.935,P=0.001、0.000、0.000)。
3.RA滑膜Foxp3+Tregs与病情活动性的关系
RA重度活动组患者28个关节压痛朋中胀指数、DAS评分均较中度活动组增加,两者有统计学差异(P=0.003、0.021、0.000)。RA滑膜Foxp3+Tregs的数量与28个关节压痛指数、DAS28评分分别呈负相关(r=—0.568、—0.656,P=0.003、0.000)。
4.RA滑膜Foxp3+Tregs与放射学关节破坏指标的关系
RA重度活动组患者关节X线狭窄评分较中度活动组增加,两者有统计学差异(P=0.005)。RA滑膜Foxp3+Tregs的数量与关节X线狭窄评分、侵蚀评分和Sharp评分分别呈负相关(r=—0.927、—0.781、—0.885,P=0.000、0.000,0.000)。
结论:
1.Foxp3在RA滑膜中表达增高,主要表达于滑膜衬里下层T细胞的胞核。其中重度活动组较中度活动组表达明显减少,提示Foxp3+Tregs数量减少可能与滑膜局部炎症反应持续有关。
2.RA滑膜Foxp3+Tregs与滑膜衬里层增生程度、滑膜炎积分、DAS28评分、28个关节压痛指数、放射学关节破坏指标分别呈负相关,表明RA患者炎症局部的Foxp3+Tregs与RA滑膜炎症、疾病活动和关节破坏有关,有望成为治疗RA新的靶点。