德国小蠊（Blattella germanica）作为一种病媒昆虫,广泛存在于世界各地。它可以携带并传播多种病原体,是霍乱、鼠疫、麻风病及伤寒等疾病传播的重要载体。化学杀虫剂的大量使用,导致德国小蠊已对多类杀虫剂产生了抗药性。因此,开发新型高效环保的生物灭蟑制剂显得尤为重要。金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）作为一种常见的病原真菌,以其为主要成分的生物制剂具有专一性强、安全性高和可持续控制等优点,但起效慢,作用不稳定等缺点限制了它的生产应用。基于文献报道以及本实验室的前期研究发现,绿僵菌和无机杀虫剂硼酸复配对德国小蠊具有明显的增效效应,但其协同机制目前尚不清楚。基于此,本研究选用具有明显增效效果的组合（1.2%的硼酸毒饵vs.1×10~9cfu/m L的绿僵菌菌悬液）作用于德国小蠊,从中肠的组织病理学、肠道菌群的区系结构与功能以及免疫防御等方面揭示硼酸与绿僵菌的协同机制,为开发高效环保的复配型真菌杀虫制剂奠定基础。本研究取得的实验结果如下:1.硼酸与绿僵菌复配对德国小蠊中肠组织病理学的影响利用石蜡切片探究1.2%的硼酸与1×10~9cfu/m L的绿僵菌复配第4 d（复配组达到死亡高峰）对德国小蠊中肠组织的影响。结果表明,对照组德国小蠊的中肠结构完整,微绒毛整齐紧密排列,完整有序的基底膜和肌肉连接系统将中肠上皮与血淋巴分开;相比之下,摄入硼酸会导致中肠上皮的实质性破坏,中肠腔微绒毛疏松,上皮细胞间出现空泡化,细胞核排列紊乱,基底层的完整性受到破坏;而单独摄入绿僵菌对中肠没有明显的影响;复配对德国小蠊中肠的影响与单独硼酸处理的相似,但在微绒毛上发现了绿僵菌分生孢子的定殖,推测硼酸能够破坏德国小蠊中肠结构协助绿僵菌穿过围食膜等物理屏障。2.硼酸对绿僵菌侵染德国小蠊进程的影响对复配处理的德国小蠊血淋巴进行镜检,发现复配第1 d绿僵菌侵入德国小蠊的血淋巴,而绿僵菌组第2 d才能在血淋巴中检测到孢子。利用q RT-PCR技术对复配处理后第3 d、4 d和5 d的德国小蠊肠道和血淋巴中绿僵菌的相对丰度进行表征。可以发现,复配组德国小蠊肠道和血淋巴中绿僵菌的相对丰度均显著高于绿僵菌组（P＜0.05）,进一步证实,复配组的绿僵菌能够更快的侵入血淋巴并显著增殖。3.硼酸与绿僵菌复配对德国小蠊肠道菌群的影响基于16S r RNA的高通量测序技术对复配处理第4 d的德国小蠊肠道菌群的变化进行表征。硼酸、绿僵菌以及二者复配均对德国小蠊的肠道菌群结构造成显著影响,其肠道中的最优菌门由对照组中的拟杆菌门（Bacteroidetes）变为厚壁菌门（Firmicutes）。四个处理组的菌属数相似,但相对丰度存在显著性差异。复配组中的副拟杆菌属（Parabacteroides,9.40%vs.4.32%,P＜0.01）和肠球菌属（Enterococcus,3.54%vs.1.74%,P＜0.05）的相对丰度显著下降;而魏斯氏菌属（Weissella,12.05%）的相对丰度要显著高于对照组（1.41%,P＜0.01）和绿僵菌组（3.54%,P＜0.05）。结果表明,复配能够造成德国小蠊肠道菌群失衡,这可能是引发硼酸与绿僵菌产生增效效果的重要原因。4.差异肠道菌魏斯氏菌的功能验证利用体外培养从肠道中成功分离了魏斯氏菌,并用q RT-PCR技术对复配处理第4 d的德国小蠊肠道和血淋巴中魏斯氏菌的相对丰度进行检测,发现复配组试虫肠道和血淋巴中魏斯氏菌的相对丰度都高于其它三组,其中在血淋巴中的相对丰度达到了对照组的2.35倍,绿僵菌组的2.37倍以及硼酸组的1.54倍（P＜0.05）。经口回殖魏斯氏菌对德国小蠊基本无毒力;体壁注射魏斯氏菌,高浓度实验组（1×10~9cfu/m L）会造成大量试虫死亡（51.67±5.77%,P＜0.001）。此外,对德国小蠊进行回殖魏斯氏菌或去除肠道菌处理再进行复配,能显著的降低其LT50（P＜0.05）。5.硼酸与绿僵菌复配对德国小蠊免疫基因表达的影响利用q RT-PCR技术对复配处理第12 h、24 h、48 h、72 h和96 h的德国小蠊体内与抗真菌相关的6个免疫基因的表达量进行检测,发现在绿僵菌侵染后,除Bg Fas 1基因外,其余五个基因的表达量与对照组相比均出现了不同程度的上调,而Bg Fas 1基因的表达除72 h略有上升外（对照组的1.62倍）,其余时间点均未显著升高。硼酸侵染后,Bgchi、CYP4G19、Akirin基因的表达上调,Bg Po、Bg Fas 1、Drs-7基因的表达下调。值得注意的是,硼酸与绿僵菌复配处理的德国小蠊,其体内的这些与抗真菌相关的免疫基因的表达几乎全部都显著的低于同时期的绿僵菌组,其中48 h时绿僵菌组Bg Po和CYP4G19的表达量达到了复配组的15.83和11.14倍。6.硼酸与绿僵菌复配对德国小蠊多酚氧化酶和过氧化氢酶活性的影响利用q RT-PCR技术对复配处理第12 h、24 h、48 h、72 h和96 h的德国小蠊肠道和血淋巴中多酚氧化酶（PO）活性的动态变化进行表征。发现复配组德国小蠊肠道中的PO活性均低于其它两组,且在72 h与96 h时具有显著性差异（P＜0.05）,其中在72 h时是硼酸组的0.27倍,绿僵菌组的0.03倍。过氧化氢酶（CAT）活性的结果表明,复配组德国小蠊肠道和血淋巴中该酶的活性均显著低于其它两个处理组（P＜0.01）,且极显著低于对照组（P＜0.001）,其中在72 h时,复配组血淋巴中的CAT活性仅为硼酸组的0.23倍,绿僵菌组的0.22倍,对照组的0.30倍。结果证实,硼酸与绿僵菌复配能够降低PO活性,同时,显著抑制CAT的活性。综上所述,硼酸与绿僵菌复配能够破坏德国小蠊的中肠结构,加速绿僵菌进入血淋巴并有利于其在肠道和血淋巴中的定殖;同时能够造成德国小蠊肠道菌群的失调,肠道中的条件性致病菌魏斯氏菌过量增殖并进入血淋巴,协同加速德国小蠊死亡。此外,复配还能降低昆虫体内与抗真菌相关的免疫基因的表达并降低多酚氧化酶与过氧化氢酶的活性,减弱昆虫的免疫防御作用,加速绿僵菌侵染,产生显著的协同效应。