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目的:口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤。肿瘤细胞可产生细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)进入血液循环,并进一步进入多种体液内,如尿液、唾液、乳汁等。EVs携带肿瘤细胞的部分生物学标志物,其内包裹的miRNA是一种常见的肿瘤液体活检指标。本研究拟检测OSCC患者及健康人唾液来源的EVs中miRNA可否作为诊断标志物,并检测OSCC患者手术前后唾液来源的EVs中miRNA的变化,以确定其可否作为术后疗效判断的标志物。材料和方法:收集17例OSCC患者唾液,同时收集11例年龄相仿、无口腔病损且无口腔炎症的健康人唾液作为对照。提取唾液中的EVs,采用透射电子显微镜进行形态鉴定,采用蛋白免疫印迹方法检测蛋白标志物,对提取的EVs进行鉴定。BCA蛋白定量法测定EVs中总蛋白浓度,Trizol提取唾液EVs中总RNA,Nano Drop检测总RNA浓度。在检测EVs中miRNA的表达水平实验中我们以线虫来源的Cel-miR-39作为外参。具体实验方法为,提取EVs总RNA,采用Prime Script?RT Master Mix试剂盒进行逆转录,实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,q PCR)实验方法检测OSCC患者组和健康对照组EVs中miRNA相对Cel-miR-39的表达差异。此外,我们还收集了6例OSCC患者术前的血液,提取血浆EVs,q PCR实验方法测定OSCC患者血液和唾液EVs中miR-21-5p的表达。对于唾液EVs中的miRNA可否作为术后疗效判断的标志物,我们收集了7例OSCC患者术后1月的唾液EVs,测定miR-21-5p、miR-486-5p、miR-512-3p、miR-412-3p、miR-10b-5p的表达,并与术前相对表达量进行比较。结果:透射电镜结果显示我们提取的唾液EVs具有典型的EVs形态,呈圆形,双层膜结构。蛋白免疫印迹结果证实我们提取的唾液EVs表达常见的EVs标志物。测定唾液EVs中总蛋白和总RNA含量结果显示OSCC患者的唾液EVs中总蛋白浓度显著高于健康对照组,总RNA浓度在两组之间没有显著差异。随机选取6例OSCC患者,收集了他们术前的血液和唾液,检测患者血液和唾液来源EVs中miR-21-5p的表达情况,发现血液EVs中miR-21-5p和唾液EVs中miR-21-5p表达趋势基本一致,呈正相关(R2=0.6951),Pearson相关性为0.834(p<0.05)。由于唾液取材较血液方便无创伤等优势,因此唾液来源EVs的miRNA较血液更常适合作为OSCC液体活检。在17例OSCC患者与11例健康对照组中,唾液EVs中miR-21-5p和miR-10b-5p在OSCC患者中的相对表达量显著高于健康对照组,绘制受试者工作曲线(Receiver-Operating Characteristic,ROC),曲线下面积分别为0.936,95%可信区间为(0.849~1.023),p=0.0001;0.807,95%可信区间为(0.646~0.967),p=0.0069,可以作为潜在的OSCC辅助诊断的标志物。而miR-486-5p、miR-512-3p、miR-412-3p在OSCC患者中与健康对照组中的相对表达量没有显著差异。这可能由于样本的地域差异,也可能是我们收集的样本数量不足而导致,我们将增加样本数量,在实验中进一步验证。通过比较OSCC患者术前术后表达差异,我们发现OSCC患者唾液EVs中miR-21-5p的表达量在6例OSCC患者术后均显著低于术后,1例在术后1月高于术前,该患者在术后3月低于术前,因此,认为miR-21-5p在OSCC患者术后表达下调,可以作为一个术后疗效判断标志物。而miR-512-3p在4例患者术后显著低于术前,miR-486-5p在3例中术后显著低于术前,miR-412-3p在1例术后显著低于术前。这些miRNA表达变化暂无发现特殊规律,还需结合患者预后的情况进一步判断,也将在研究中增加样本数量进一步验证。结论:1.OSCC患者唾液EVs中miR-21-5p和miR-10b-5p表达较健康人唾液EVs中上调,可作为OSCC潜在的辅助诊断标志物。2.OSCC患者唾液EVs中miR-21-5p表达在术后显著降低,有望成为判断术后疗效的指标之一。