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对于包括绝大多数鱼类、两栖爬行类和鸟类在内的卵生动物,卵黄发生是卵子发生过程中的关键阶段之一。在卵黄发生中,卵子将积累大量的卵黄蛋白(yolk proteins,YPs),为早期胚胎体外发育提供能量和营养来源。YPs是卵黄蛋白原(vitellogenin,Vtg)通过卵黄蛋白原受体(vitellogenin receptor,VtgR)进入卵母细胞后积累的产物。YPs的前体Vtg通过何种VtgR进入卵母细胞一直是研究的热点。然而到目前为止,脊椎动物的VtgR还未完全确定,缺少直接的功能证据。在本研究中,我们以斑马鱼(Danio rerio)为动物模型,针对VtgR展开了系统性的鉴定和分析。(1)利用卵黄脂磷蛋白(lipovitellin,Lv)抗体,通过Western blotting和荧光免疫组化证实了在斑马鱼中卵黄发生过程依赖于Vtg的摄入。(2)已有证据表明VtgR基因属于低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor,LDLR)家族,为鉴定何种VtgR介导Vtg的摄入,针对目前所有斑马鱼的LDLR家族成员基因,根据在卵巢中表达量的高低进行了筛选。发现vldlr,lrp13a和lrp13b(通过系统进化分析将lrp13和si:dkey-88l16.3分别命名为lrp13a和lrp13b)这3个基因在斑马鱼卵巢中的表达量最高,推测这3个基因可能是斑马鱼的VtgR的候选基因。(3)半定量逆转录聚合酶链式反应(Semi‐quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,半定量RT-PCR)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Realtime Quantitative polymerase chain reaction,qPCR)结果表明,vldlr,lrp13a和lrp13b除了主要在斑马鱼的卵巢中表达外,在斑马鱼的体组织中也有少量表达,其中vldlr主要是在大脑、肌肉和肾脏中表达,lrp13a和lrp13b主要是在肾脏、肌肉和小肠中表达。(4)qPCR结果表明vldlr,lrp13a和lrp13b都主要在斑马鱼卵巢的卵母细胞中表达。在卵黄生成过程中,vldlr,lrp13a和lrp13b在斑马鱼卵黄发生过程中总体上的表达变化不明显,但始终维持在一定的水平上。(5)为研究这3个VtgR候选基因是否受到黄体生成素(luteinizing hormone,LH)的调控,利用qPCR分析了这3个候选基因在人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)所诱导的卵母细胞成熟中的表达变化,发现这3个基因的表达水平并无明显变化,其表达均不受LH的调控。(6)利用新型的基因敲除方法——基于CRISPR/Cas9的单基因四位点敲除技术(可快速在G0代观察到表型),对这3个候选基因的功能进行了分析。利用该方法,在斑马鱼中成功的敲除了3个候选基因。vldlr G0成年斑马鱼进行自交后所产胚胎存活率在24hpfs时下降最为显著,lrp13a G0和lrp13b G0斑马鱼所产胚胎的存活率也有一定程度的下降,且lrp13a G0略大于lrp13b G0。而且发现同一条G0成鱼产的胚胎,其大小有差异,差异程度排序为vldlr G0>lrp13a G0>lrp13b G0。由此可见vldlr,lrp13a和lrp13b G0成年斑马鱼的生殖力受到了一定程度的影响。(7)为进一步确认vldlr,lrp13a和lrp13b这三个候选基因在卵黄发生中的功能,进一步使用了传统的CRISPR/Cas9基因敲除技术获得纯合敲除系的斑马鱼。目前该实验已成功获得F2代斑马鱼。通过以上研究结果,初步确定了vldlr,lrp13a和lrp13b为斑马鱼VtgR的候选基因,vldlr基因在卵黄发生中的功能可能更为重要,这些VtgR可能还存在多个受体的补偿作用。这也是首次通过基因敲除方法在脊椎动物中探究VtgR的功能。本研究中的发现有助于对鱼类卵黄发生分子机理的理解,为鱼类卵子的体外培养和重建的研究提供重要信息。