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衰退病是柑橘上最具毁灭性的病毒性病害之一,已导致全世界多个柑橘主产区的柑橘树死亡。柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)主要通过感病接穗嫁接和蚜虫取食进行传播,全基因组包含12个开放阅读框,其中ORF6编码的外壳蛋白覆盖了病毒粒子约95%的全基因组,其与CTV致病力相关且是病毒装配过程中所必须的。CTV还存在明显的株系分化,并可分为多种基因型。根据CTV在寄主上表现不同感病症状可分为苗黄型、茎陷点型、速衰型三种分离株类型;根据CTV全基因组序列差异还可将CTV划分为七种基因型。本研究调查了赣南柑橘果园的衰退病发病情况;通过RT-PCR技术对感染CTV的样品扩增目的片段并克隆测序,进行遗传多样性分析;利用两类基因型鉴定引物分析样品的基因型,并对部分样品进行片段克隆测序和序列分析遗传,明确赣南地区CTV分离株的遗传多样性和基因型组成。实验结果如下:1、在江西赣南15个县(市、区)的柑橘果园以随机采样的方式,收集了351份品种均为纽荷尔的柑橘样本,抽提样本总RNA进行CTV的CP(Coat protein,CP)基因RT-PCR扩增。实验所得数据显示,有175份样品感染CTV,单个采样点的感染率在39.3%~69.3%,平均感病率在49.85%,结果表明柑橘衰退病在赣南地区的柑橘果园普遍发生。2、随机选取78份阳性样本扩增CTV的CP基因并克隆测序,分析序列基因重组和碱基含量,并将所测序列与10个致病性不同的国外CTV分离株进行核苷酸遗传距离、序列同源性和系统进化分析。分析可知:采自江口编号为JK4的样品在35~490nt区域之间存在基因重组,该重组事件被5种运算法则检测到,P值在3.746×10-4~1.811×10-2之间;78份样品的平均GC含量为52.8%,AT(U)含量为47.2%,平均碱基含量GC>AT;78份样品CP基因核苷酸遗传距离在0.000~0.072,与10个国外CTV分离株遗传距离在0.005~0.106;样品的CP基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为94.7%~100%,92.3%~100%,与10个国外CTV分离株的分别为76.5%~84.1%,73.6%~80.3%;系统聚类分析发现,多个采自同一地点的样品在聚类树上分处于不同组群且分支远近不同,部分样品与国外茎陷点型和衰退型CTV分离株聚为一支,它们序列相似性相对较高。实验结果表明赣南地区CTV分离株CP基因保守性较高,序列存在一定程度的变异,各采样点的CTV分离株之间亲缘性较高但与国外CTV分离株之间亲缘性相对偏低,大部分赣南地区的样品可能存在混合侵染现象。3、分别利用Hilf、Roy设计的引物鉴定135份样品的基因型。Roy的引物鉴定显示:有43份样品为单基因型,基因型分别为VT、T3、B165,均由强毒型分离株组成;41份样品的基因型混合了两种分离株,其中有5份由强弱毒分离株混合,36份由强毒分离株混合;基因型包含三种分离株的样品中,有4份基因型为VT+T3+T36,剩余4份基因型混合了强弱毒分离株;基因型混合四种分离株的样品有8份,其中2份为VT+T3+T36+B165组合,6份为VT+T3+T30+T36组合;还有35份样品无法判断基因型。Hilf的引物鉴定显示:有44份样品为单基因型,也均由强毒型分离株组成,其中最多的是VT基因型,其次为T36基因型,T3基因型较少;有35份样品的基因型包含了两种分离株,基因型均由强毒型分离株组成的有两种:VT+T36和VT+T3,这两种基因型样品有25份,剩余10份样品基因型混合了强弱毒分离株;8份样品的基因型包含三种分离株,其中有4份为VT+T3+T36组合,3份为VT+T30+T3组合,T3+T30+T36组合的样品仅1份;有一份样品的基因型包含了4种分离株;还有47份样品无法鉴定基因型。结合两组实验数据可知:赣南地区存在VT、T3、T30、T36和B165五种基因型;其中大部分样品基因型包含多种分离株,基因型组合复杂多样;VT分离株在样品的基因型中出现的频率最高,基因型组合为VT+T3、VT+T36的样品较多;部分样品利用两类引物鉴定基因型结果不一致,还有部分样品利用两类引物均无法鉴定基因型。4、分别选取了9份用两类引物鉴定结果相同和不同的样品,利用Hilf的引物扩增样品的目的片段并克隆测序,分析其遗传信息。结果表明:5’、k17序列发育树中,与参考分离株聚为一支或一组的样品通过两类引物鉴定均显示基因型包含相应的参考分离株,它们之间序列相似性较高,遗传距离也较近;多份样品通过两类引物鉴定基因型均显示包含某种分离株但并没有与相应的参考分离株聚为一组,它们之间序列相似性较低,遗传距离也较远。实验结果表明赣南地区CTV分离株的基因型分离株组成较为复杂,极有可能包含新的分子变种或未知基因型。