一、研究背景: 鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我国常见的恶性肿瘤，好发于南方地区，其发病有明显的种族地区和家族地区聚集现象。据估计，世界上80％的鼻咽癌发生于我国。鼻咽癌发病率占头颈部肿瘤的首位，发病年龄在3-84岁之间，以30-50岁多见，男性发病为女性的2-3倍。鼻咽癌已经成为严重威胁我国人民生命和健康的十大恶性肿瘤之一。 鼻咽癌多属低分化鳞状细胞癌，大多数对放射治疗有中度敏感性，其邻近结构对放射线亦有较高的耐受性，因此，目前治疗鼻咽癌的主要手段是放射治疗结合全身化疗。但临床发现患者的放射敏感性存在个体差异，导致治疗效果亦出现很大的不同。影响肿瘤细胞放射敏感性的因素很多，细胞凋亡是重要因素之一。自1972年Kerr发现自然界存在细胞凋亡现象以来，人们对凋亡的认识不断加深，并陆续发现了如Bcl-2等一系列的凋亡调控基因，同时也促进了鼻咽癌细胞凋亡机制的研究。 酪氨酸激酶Etk（The endothelial/epithelial tyrosine kinase）是近年来发现的与细胞凋亡相关的，非受体类酪氨酸激酶Btk（Bruton’s tyrosine kinase）家族中的一员。它首次发现于前列腺癌细胞，并在人骨髓细胞中得以鉴定，故又名骨髓x激酶（bone marrow X kinase，Bmx）。该基因位于染色体臂Xp22．2，DXS197与DXS207两位点之间，其CDNA由一段包含有675个氨基酸的开放阅读框架组成，该区域集中了Btk家族的5个功能结构域：PH、TH、SH3、SH2和Src1。 研究发现，Etk是Btk家族中唯一一种不仅分布于淋巴造血细胞，而且在上皮细胞和血管内皮细胞中表达的非受体类酪氨酸激酶。尽管其在上皮细胞中的表达水平不高，但研究发现它在上皮细胞的增殖、分化、凋亡和肿瘤的发生过程中起重要调控作用。有人证实，Etk对神经营养生长因子介导的非雄激素依赖性前列癌细胞的生长有重要作用；实验发现，Etk参与了IL-6介导的神经内分泌性前列腺癌细胞的分化。亦有研究证实，Etk参与了乳腺癌上皮细胞的增殖和分化，并作为下游区的信号分子，参与了表皮生长因子受体（EGFR）介导的细胞凋亡信号的传导。 RNA干扰（RNA interference，RNAi）又称基因沉默，是生物体内的一种自然现象，其机理为：外源性或内源性的长双链RNA被核苷酶Dicer切割降解为21-23个核苷的小分子干扰RNA（siRNA）双链，该siRNA分子被嵌合进含有核苷酶的多蛋白复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）中，被其中的RNA解螺旋酶解开双链后的正义链随后降解，由此激活的RISC复合体由该siRNA的反义链介导，靶向与该反义链序列互补的mRNA，并形成新的长双链RNA，然后又被Dicer酶降解为新的siRNA片段，靶mRNA即被降解或沉默，得到的siRNA进入新一轮基因沉默循环。siRNA分子的基因沉默功能相对于同为核酸类分子的反义核酸和核酶（ribozymes），特异性及沉默效应更强且无免疫原性。因此，国内外许多研究机构迅速采用了siRNA分子技术来进行疾病治疗的研究，任何与疾病有关的表达基因都是潜在的靶标。 本实验室前期体外细胞学试验发现：升高鼻咽癌细胞株sune中的Etk/BMX可以抑制该细胞株凋亡，并能增强鼻咽癌细胞株对放射线的抵抗作用。本次实验旨在此基础上进一步通过体内试验探讨两个问题：1、Etk/BMX对体内鼻咽癌细胞增殖有无影响?2、Etk/BMX对体内鼻咽癌细胞增殖的放射敏感性有无影响?另一方面，结合以上原则及参考文献，设计出了抗Etk/BMX的siRNA靶序列，其序列为：5’-AAA GAA GGA GCA UUU AUG G dTdT-3’，EtksiRNA分子序列为：正义链（sense）：5’-AAA GAA GGA　GCA UUU，AUG G dTdT-3’；反义链（Antisense）：5-dTdT UUU CUU CCU CGU AAA UAC C-3’。本实验将通过基因沉默技术降低另一株高Etk/BMX表达的鼻咽癌细胞株5-8F中的Etk/BMX，其对放射敏感性有无影响?有助于我们进一步了解Etk/BMX的功能如何。　　 二、目的: 拟通过sune细胞转染建立高Etk/BMX表达细胞株sune-wt，用平板克隆试验来研究转染前后细胞的增殖能力。BALB/Cnu/nu裸鼠体内接种转染前后的细胞株来观察两种鼻咽癌细胞移植瘤的生长情况及对放射线的敏感性；拟通过5-8F细胞基因沉默建立低Etk/BMX表达细胞株（s5-8F），用MTT试验来研究Etk/BMX沉默前后细胞对射敏感性的影响。为探讨鼻咽癌放射抵抗性的可能机制提供实验依据。　　 三、方法: 1．选取鼻咽癌细胞株中表达Etk/BMX较低的sane作为细胞本株，利用脂质体2000将野生型酪氨酸激酶Etk/BMX表达质粒pcDNA3．1-Etk导入其中，经过筛选扩大培养成功建立Etk/BMX稳定高表达细胞株sane-wt，同时导入空质粒pcDNA3．1转染细胞作为对照（sane-vector）。 2．流式细胞仪上检测Etk/BMX蛋白表达阳性率，每种分组每种蛋白设三次重复。 3．平板克隆形成率试验和裸鼠成瘤试验测试上述三组细胞在体外和BALB/Cnu/nu裸鼠体内的变化，观察其成瘤速度。体内当成瘤到一定时间（21天）时对其进行X线照射（5Gy）×5天。观察其肿瘤变化情况（见图四）。 4．选取鼻咽癌细胞株中表达Etk较高的5-8F作为细胞本株，利用脂质体2000将特定设计的针对Etk的RNA诱导沉默复合物siRNA整合到5-8F细胞中，通过这个RNA干扰途径降低5-8F细胞中Etk/BMX表达率，建立72小时内可以稳定表达的Etk/BMX低表达细胞株s5-8F，并用X射线（0、2、4、10、15Gy）进行照射，MTT法测定细胞的OD值。 5．Western blot技术分析Etk/BMX高表达5-8F细胞株和Etk/BMX基因沉默后的s5-8F细胞株中Etk蛋白的表达。　　 四、结果: 1．成功转染出高Etk表达的细胞株sune-wt：利用流式细胞仪对细胞株sune和sune-wt进行检测。sune表达率为4．6±1．45％，sune-wt表达率为75．5±2．34％sune-vector表达率为4．8±1．45％。 2．sune-wt组平板克隆形成率均显著高于对照组sune（P<0．002）。 3．皮下接种细胞成瘤结果示：sune-wt较之sune-veetor和sune成瘤率高且增殖速度快，sune-wt接种一次成功率较sune高。经5Gy射线照射后，sune-wt体积增长较之sune-vector和sune-1快，差异显著（见表二）。 4．成功的建立72小时内可以稳定表达的Etk/BMX低表达细胞株s5-8F，在4Gy射线照射后，MTT法测定各组细胞的OD值。不同剂量X线照射后s5-8F组OD均低于5-8F（P<0．000）。 5．Western blot分析技术Etk/BMX高表达5-8F和Etk/BMX基因沉默后的s5-8F细胞株中Etk蛋白的表达。结果显示基因沉默后的s5-8F中Etk/BMX表达明显低于Etk/BMX高表达5-8F（见图六）。　　 五、结论: 　 1．平板克隆试验体外实验发现：升高鼻咽癌细胞株Etk/BMX的表达有促进细胞增殖的作用。 2．裸鼠体内试验发现：升高鼻咽癌细胞株中Etk/BMX有促进体内移植瘤增长的作用，移植瘤放射后结果进一步发现升高Etk/BMX有降低鼻咽癌细胞移植瘤放射敏感性。 3．5-8F沉默试验进一步发现：降低鼻咽癌细胞中Etk/BMX的表达能增强鼻咽癌细胞株的放射线敏感性。