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昆虫多酚氧化酶具有多种重要的生理功能,例如:可以在入侵的病原微生物周围激活并产生黑化反应,迅速有效地杀死入侵的病原菌;也可以促进伤口愈合以及表皮糅化。昆虫多酚氧化酶的激活通路现在了解得比较透彻。昆虫多酚氧化酶不具有信号肽,多酚氧化酶是如何从血细胞中释放的机制现在还不清楚,目前一般认为是血细胞通过破裂后释放的,这是根据体外观察推测来的,缺乏体内变化的证据。 为了研究这个问题,首先在果蝇的三个多酚氧化酶基因的3端分别与绿色荧光蛋白基因融合,并在S2细胞中过表达。酶活检测和荧光观察的结果显示多酚氧化酶绿色荧光融合蛋白可以在S2细胞中表达,同时具有荧光和酶活性,每一个融合蛋白与对应的多酚氧化酶蛋白具有相同的生化性质。进一步的试验表明果蝇rPPO1-GFP可以被丝氨酸蛋白酶类剪切并激活,并且在昆虫血淋巴未知蛋白的介导下rPPO1-GFP可以和白僵菌的孢子、微球菌结合,说明rPPO1-GFP具有潜在的免疫活性,并可以方便应用于免疫以及多酚氧化酶的分泌或转运研究。 为了了解果蝇多酚氧化酶的分泌机制,在果蝇PPO1基因的5端分别接上不同的信号肽或者含信号肽蛋白,相关融合蛋白在S2细胞中过表达。酶活检测和Western blot结果表明不同的信号肽不影响相关融合蛋白在S2细胞的表达,融合蛋白也可以分泌但是没有活性。通过体外去糖基化和质谱鉴定试验,表明人为增加信号肽的多酚氧化酶在S2细胞表达后发生了糖基化修饰。 家蚕的后肠存在多酚氧化酶,并可以被分泌到内容物中,这显然不是血细胞裂解可以解释的。通过体外培养家蚕H1组织,结果表明H1组织可以释放包括多酚氧化酶在内的376种蛋白到培养基中。并且一部分蛋白与胞吐途径密切相关。钙离子、镧离子和钆离子在体外可以抑制H1组织释放多酚氧化酶。根据相关试验结果,推测昆虫细胞胞吐作用而不是细胞裂解参与了多酚氧化酶的释放。利用果蝇的遗传优势,期望在将来的研究当中可以确认多酚氧化酶的释放机制。