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生物钟是生物体对地球自转和公转引起的光照、温度环境因子的周期性变化长期适应,从而演化存在的内在的,自发的计时机制。生物钟系统由输入通路,中央起搏器或振荡器,输出通路组成。输入通路感受授时因子信号,并传递至中央起搏器,中央起搏器通过转录翻译以及修饰产生分子振荡,而输出通道则通过分子振荡调控下游各种生命过程,包括代谢稳态。生物体随着昼夜能量需求的波动,代谢生理也表现出相应的振动变化以适应机体需要。本文利用家蚕这一鳞翅目昆虫模式生物,研究授时因子、生物钟振荡器和代谢之间的关联,探讨生物钟输入通路、中央起搏器和输出通路的机制。通过对家蚕个体和细胞系进行授时处理,进一步通过敲降生物钟核心基因构建突变细胞系,同时利用代谢组学、酶活性测定、基因表达分析以及生物信息学分析等方法,验证代谢通路的变化,分析生物钟对代谢的影响机制;利用免疫荧光和实时定量PCR方法验证预测的家蚕生物钟核心振荡器通路的分子功能。研究获得的主要结果如下:(1)授时因子通过亲源因子影响子代家蚕受精时期的代谢通路在亲代生殖细胞快速发育、生殖细胞快速发育成熟的蛹期第6-9 d(P6-P9),32℃高温长光照逆境环境(32LL)暴露72 h,诱导卵受精障碍,进一步研究了子代卵受精过程中能荷和糖代谢的变化。结果显示,常温自然光照(25LD)环境中,进入家蚕卵内的精核,脱离母体后经过2h左右的长距离移动,才能够与同时也在卵黄内移动中的卵原核结合。在这一缓慢的受精过程中能量代谢不是依靠TCA,而是依靠果糖为底物之一的糖酵解。亲代逆境环境暴露后,子代卵的受精关键时期能荷值下降,NAD~+再生障碍,糖酵解过程受阻于丙酮酸代谢环节,出现受精前的乳酸和丙酮酸的积累,并对合子形成或受精后的合子分裂产生不良影响,表现为蚕卵受精率下降。结论是异常授时因子环境能够通过亲源因子调控糖酵解途径影响家蚕子代卵受精。(2)敲降生物钟基因BmPer和BmCry1导致家蚕BmN细胞系代谢异常家蚕与果蝇和小鼠不同,只有一种昼夜节律核心振荡周期蛋白(BmPER)。我们构建了能够表达BmPer_dsRNA载体,在家蚕卵巢细胞系BmN实现了持续敲降BmPer基因的表达,并筛选出细胞生长缓慢、个体小的发育障碍模型Per-KD细胞系。GC/LC-MS检测的细胞代谢组学结果显示,在脱离生物体内分泌激素影响的BmN培养细胞中,敲降BmPer基因表达,以丙酮酸和乳酸为代表代谢物质的糖代谢受到显著抑制,以糖代谢中间产物为原料的氨基酸代谢水平也发生了群体下调。同时,细胞的脂质代谢和核苷酸代谢水平显著上调。代谢物关联分析结果也显示,丙酮酸和乳酸与糖代谢,以及天冬氨酸,丙氨酸,黄嘌呤等其他通路代谢物质密切相关。进一步的验证实验结果显示,糖代谢的关键酶BmHK,BmPFK和BmCS的活性显著降低,编码基因BmHk,BmPfk,BmPk和Bm Cs的转录水平也显著下调。结论是抑制生物钟基因BmPer的表达阻遏了细胞的糖代谢,并可能进一步与细胞的氨基酸代谢变化甚至细胞生长发育关联。构建了能够表达BmCry1_dsRNA的载体,持续敲降BmN细胞的隐花色素蛋白基因BmCry1表达,进一步筛选出细胞生长速度加快、形态变小的发育障碍模型Cry1-KD细胞系。代谢组学测定结果显示,在没有家蚕内分泌激素影响的培养细胞中,敲降BmCry1基因表达,葡萄糖-6-磷酸和丙酮酸水平显示的糖代谢水平显著提升,以糖代谢中间产物为原料的氨基酸代谢水平也有上调趋势。同时,核苷酸代谢水平也显著上调。代谢物关联分析结果显示,葡萄糖-6-磷酸和丙酮酸与糖代谢类、氨基酸代谢类和核苷酸代谢类物质密切相关。进一步的验证实验结果显示,糖酵解途径中关键酶BmHK,BmPFK,BmPK活性及其编码基因的表达水平发生总体上调的变化,并且这种变化与糖酵解中代谢物质的含量变化吻合。结论是抑制生物钟基因Bm Cry1的表达呈现出代谢问题的整体异常,并且提高了细胞的糖代谢,这可能与代谢途径中关键酶的表达水平和酶活性变化有关。敲降生物钟基因BmCry1和BmPer的BmN细胞,代谢变化的相似之处是细胞变小,核苷酸代谢水平显著上调的现象;而不同之处是细胞中糖代谢和氨基酸代谢的变化趋势几乎相反,并且Cry1-KD细胞系生长速度加快,而BmPer-KD细胞系生长速度变慢。(3)授时因子光制与温度在家蚕BmN细胞中可能的生物钟核心振荡器通路差异以敲降BmCry1,BmCry2和BmPer基因的BmN细胞系为材料,使用qPCR和细胞免疫组化实验对预测的家蚕核心振荡器分子通路进行了验证,结果显示,BmCRY1蛋白能够接受光授时信号,BmPER蛋白则传递这个信号,并在BmCRY2蛋白协助转运下进入细胞核,同时BmTIM蛋白也在BmCRY2蛋白协助转运进入细胞核。同样在Cry1-KD,Cry2-KD和Per-KD这3个BmN细胞系中,基因转录水平和已有研究中BmN细胞的蛋白质表达的亚细胞定位与核质分离Western blotting实验结果显示,与光照授时作用不同,BmCRY2可能在温度授时下的核心振荡器中发挥着信号接受和反馈调节的双重作用。