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目的: 异种心脏移植是为了解决供心来源严重短缺,延长受者生命,提高受者生活质量。而超急性排斥反应阻碍了异种心脏移植的临床应用。多年来心脏移植学家们不断地进行异种心脏移植的基础研究,至今异种心脏移植排斥问题尚无良好的解决办法。有关这方面的研究主要集中在基因治疗、供体器官灌注、血浆交换、全淋巴组织照射、脾切除、免疫吸附、免疫抑制药物等方面,并已证实它们具有抑制超急性排斥反应(Hyperacute rejection ,HAR)的作用。其中有文献报导持续或间断静脉注射可溶性I 型补体受体重组蛋白能够明显抑制 HAR,供心存活时间明显延长。但采用这种全身给药的治疗方法也同时抑制了受体的全身免疫系统,对供心以外的组织器官影响大,蛋白半衰期短,而且代价昂贵。若采用心肌特异性表达重组腺病毒的方法来抑制 HAR,有可能解决这一问题。鉴于上述情况,本课题通过动物实验局部注射 sCR1重组腺病毒转染部分心肌,使目的基因在心脏局部原位表达,考察此种方法能否对 HAR 有一定的抑制作用,为今后深入研究 sCR1提供初步的依据。目前尚无有关这方面的文献报导。 方法: 1.豚鼠至 SD 大鼠颈部异位心脏移植模型的建立 选健康雄性豚鼠和 SD 大鼠为研究对象,体重分别为 200±30g 和 250±30g,0.3%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,建立豚鼠至大鼠颈部异位心脏移植模型。豚鼠及 SD 大鼠各80 只,随机配对后分 2 组进行实验:组 I(对照组,n=40)采用 Cuff 技术,组 II(实验组,n=40)采用改良 Cuff 技术。观察心脏移植后两组供心复跳情况,比较其供心存活时间。探索理想的小动物异位心脏移植模型。 2. Ad.lacZ、Ad.GFP 及 Ad.sCR1 转染豚鼠心肌及其蛋白表达的检测 选健康雄性豚鼠为研究对象,体重 200±30g,0.3%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,左侧开胸显露心脏,在左室壁注射 SLRI、Ad.lacZ、Ad.GFP 及 Ad.sCR1。40 只豚鼠随机分为 4 组进行实验:检测组 I(对照组,n=10)注射 SLRI,检测组 II(实验组,n=10)注射 Ad.lacZ,检测组 III(实验组,n=10)注射 Ad. GFP,检测组 IV(实验组,n=10)注射 Ad.sCR1。各组以左室前、侧壁为注射点,分别注药 50 微升。注药后 0.5、7、14、21 及 28 天,取心脏标本制作切片,观察重组腺病毒蛋白表达情况。 3.观察 Ad.lacZ、Ad.GFP 及 Ad.sCR1蛋白表达高峰期 2<WP=7>第二军医大学硕士学位论文 中文摘要 胸心外科专业 转染后 0.5、7、14、21 及 28 天,在检测组 II、III、IV 中每组随机取一只转染动物,于注射点处行心肌组织切片镜检,每张切片随机取 10 个 200 倍视野进行阳性细胞计数,计算每张切片 10 个视野内转染的阳性心肌细胞平均数,每组共计数均为 50 个视野。比较各组蛋白表达的高峰期。 4. sCR1 对异种心脏移植超急性排斥反应的抑制作用 选雄性健康豚鼠和 SD 大鼠为研究对象,体重分别为 200±30g 和 250±30g。豚鼠及SD 大鼠各 90 只,随机配对后分 3 组用药:移植组 I(对照组,n=30)注射 SLRI,移植组 II(对照组,n=30)注射 Ad.GFP,移植组 III(实验组,n=30)注射 Ad.sCR1。心脏移植术前 10 天左侧开胸,每组以左室前、侧壁为注射点,分别注药 50 微升。10天后,0.3%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉, 采用改良 Cuff 技术建立豚鼠至大鼠颈部心脏移植超急性排斥反应模型,比较各组供心存活时间,观察发生超急性排斥反应后供心病理学变化。 结果: 1. 成功建立豚鼠至大鼠颈部异位心脏移植模型,实验组及对照组供心平均存活时间分别为 51.8 土 6.1 和 16.6 土 6.7min,实验组供心存活时间明显延长,与对照组比较统计学差异非常显著,P<0.01。 2. Ad.lacZ、Ad.GFP 及 Ad.sCR1转染后都有蛋白表达, SLRI 组未见有蛋白表达。 3. Ad.lacZ、Ad.GFP 及 Ad.sCR1转染后约 12 小时有蛋白表达,1-2 周为表达高峰期,4 周左右表达开始消失。 4. 建立了稳定的小动物异种心脏移植模型。注药后 10 天行心脏移植术,结果显示移植组 I(SLRI)、移植组 II(Ad.GFP)和移植组 III(Ad.sCR1)供心平均存活时间分别为 51.9±7.3、51.4±7.9 和 60.6±15.7 min,实验组病理检查显示轻度炎症反应,与对照组比较统计学差异显著(P<0.05),对照组间比较统计学差异不显著(P>0.05),三组 IgM沉着没有明显差别。 结论: 1. 应用改良 Cuff 技术建立的豚鼠至大鼠颈部异位心脏移植模型简便实用稳定,重复性高。供心存活时间明显延长,说明此模型可作为研究异种心脏移植超急性排斥反应的一个较好的平台。 2. sCR1重组腺病毒能有效转染心肌细胞,注药后 1-2 周为表达高峰期,转染后 10天是进行心脏移植的较好时期。 3<WP=8>第二军医大学硕士学位论文 中文摘要 胸心外科专业3. 改良 Cuff 技术建立的豚鼠至大鼠颈部心脏移植模型可以用于超急性排斥反应的实验研究。Ad.sCR1转染供体心肌后,能够在局部抑制炎症反应,供心存活时间有所延长。本实验证明,心脏局部范围注射重组腺病毒转染心肌,只是部分地延迟了 HAR 的发生,今后尚需进一步研究,探索构建携