杆菌肽是由12个氨基酸残基组成的多肽类抗生素,具有广谱抗菌效果,是一种应用广泛的动物饲料添加剂。氨基酸是杆菌肽的合成前体,其供应对杆菌肽的合成至关重要。细菌胞外蛋白酶能够将培养基中的大分子蛋白质降解为寡肽和游离氨基酸,进而被菌体吸收利用;而全局性调控蛋白CodY对支链氨基酸的合成有着阻遏作用,codY基因的缺失会增强菌体支链氨基酸的合成能力。本文采用基因工程技术对地衣芽胞杆菌DW2进行定向改造,研究了胞外蛋白酶Epr、AprE、BprA、Vpr强化表达及codY基因缺失对杆菌肽合成的影响,意在通过强化前体氨基酸的供应,增强杆菌肽的合成。本研究利用pHY300质粒对胞外蛋白酶Epr、AprE、BprA和Vpr进行游离表达,得到工程菌株 DW2/pHY-P43epr、DW2/pHY-P43aprE、DW2/pHY-P436bpr 和DW2/pHY-P43vpr。对比分析对照菌株和重组菌株杆菌肽发酵终点胞外蛋白酶活性,结果表明,胞外蛋白酶Epr和Vpr的游离表达对菌株胞外蛋白酶的活性没有显著影响;胞外蛋白酶AprE和BprA的游离表达有效提高了菌株胞外蛋白酶活性,相比于对照菌株DW2/pHY300分别提高了 101.3%、28.1%。进一步利用T2(2)-ori整合质粒将胞外蛋白酶AprE、BprA整合表达,获得工程菌株DW2aprE和DW2bprA;AprE和BprA的整合表达菌株DW2aprE、DW2bprA的胞外蛋白酶活性相比于原始菌株DW2分别提高了 28.6%、8.6%。杆菌肽摇瓶发酵结果显示,胞外蛋白酶Epr、Vpr和AprE的游离表达对杆菌肽总效价没有影响,菌株DW2/pHY-P43aprE的杆菌肽A组分效价与对照菌株DW2/pHY300相比提高了 52.6%,表明胞外蛋白酶AprE的游离表达可明显提高杆菌肽A组分效价;菌株DW2/pHY-P436bprA的杆菌肽总效价与对照菌株DW2/pHY300相比提高了 20.5%。然而,AprE和BprA的整合表达对杆菌肽总效价和杆菌肽A组分效价均没有显著影响。为了增强菌株支链氨基酸的合成能力,本研究构建了codY 缺失菌株DW2AcocdY,摇瓶发酵结果显示,工程菌株DW2△codY的胞外缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸含量相比于原始菌分别提高了 7.56倍、1.78倍、1.38倍,但杆菌肽产量下降了 41.7%。通过RT-qPCR检测发现,相比于原始菌株,工程菌株DW2△codY支链氨基酸合成基因簇(ilvBHC-leuABC)中的ilvB和leuA基因的转录水平分别提高了4.7倍和4.9倍,调控支链氨基酸合成的bcd基因转录水平提高了 5.3倍;杆菌肽合成基因bacA与释放杆菌肽肽链的硫酯酶基因bacT分别下调了 79%、76%,编码杆菌肽跨膜运输通道蛋白的bcrB基因转录量下调了 52%。以上结果表明,codY基因的缺失虽然增强了杆菌肽前体氨基酸Val、Ile、Leu的合成,但是杆菌肽合成和转运基因的编码表达受到了明显抑制,最终导致菌株合成杆菌肽能力下降。