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【目的】 1. 探讨p-ATF1-T184在胃癌(gastric cancer,GC)转移中的作用,确定其生物学功能及临床意义。 2. 探讨 p-ATF1-T184 调控基质金属蛋白酶 2(Matrix metalloproteinase-2, MMP2)以及基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinase-9, MMP9)转录活性的作用和机制。 【方法】 1. 通过胃癌患者病理切片的免疫组织化学实验检测p-ATF1-T184在胃癌组织中的表达,收集临床资料,分析其与淋巴结转移、患者生存期等临床病理因素的相关性。 2. 转染ATF1-T184突变载体(T184D、T184A),通过划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验观察p-ATF1-T184在胃癌侵袭转移中的作用。 3. 不同细胞间ATF1、p-ATF1-T184、MMP2、MMP9的mRNA和蛋白表达水平的检测,探究它们之间的相互关系。实时定量RT-PCR、Western blot实验检测p-ATF1-T184对MMP2、MMP9的mRNA和蛋白表达水平的影响;明胶酶谱实验检测p-ATF1-T184对MMP2、MMP9活性的影响;染色质免疫共沉淀(ChIP)实验、放线菌酮实验探究p-ATF1-T184对MMP2、MMP9 转录活性的调控机制。 4. 免疫组织化学实验检测 MMP2 在胃癌组织中的表达情况,分析其与p-ATF1-T184的表达是否有相关性,以及对患者预后的影响。 【结果】 1. p-ATF1-T184免疫组化结果显示,相比于癌旁正常组织,p-ATF1-T184在肿瘤组织中高表达,且与患者的淋巴结转移成正相关。 2. 划痕实验显示转染ATF1-T184D活化突变质粒的胃癌细胞拥有更好的伤口愈合能力;Transwell实验显示,将ATF1-T184位点活化突变以后,细胞的迁移和侵袭能力增强。 3. 细胞内源性mRNA转录水平检测显示,ATF1与MMP2、MMP9的表达成正相关;细胞内源性蛋白表达水平检测显示,ATF1、p-ATF1-T184的表达与MMP2的表达基本一致,MMP9则只有三种细胞表现出一定的相关性。相对于转染ATF1野生型质粒的细胞,转染ATF1-T184活化突变质粒的细胞,其MMP2、MMP9的mRNA和蛋白的表达水平及其活性增高,转染ATF1-T184负性突变质粒的细胞则相反。磷酸化ATF1-T184可以提高ATF1和MMP2、MMP9的DNA结合能力以及ATF1蛋白的稳定性增强其转录活性。 4. p-ATF1-T184与MMP2在胃癌患者组织中高表达,患者生存率下降,且同步高表达的患者,其生存率更低。 【结论】 1. p-ATF1-T184与胃癌细胞的侵袭转移成正相关。 2. p-ATF1-T184可通过影响ATF1的DNA结合能力及蛋白稳定性,进而影响MMP2、MMP9的mRNA转录水平和蛋白表达水平及其两者的活性。 3. 胃癌患者病理组织切片的免疫组化实验表明p-ATF1-T184与MMP2正相关,且高表达组,出现淋巴结转移的患者数增加,患者预后不良。