论文部分内容阅读
研究目的:代谢综合征(Metabolic syndrome,MS),是由于能量利用和储存紊乱所导致的一系列复杂症候群,增加了非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver diseases,NAFLD)、糖尿病及心脑血管病等多种疾病的患病风险。其中,2型糖尿病(Type 2 Diabetes,T2DM)的主要临床表现为因胰岛素缺乏或敏感性降低所导致的体内高血糖,而肝脏糖异生的过度激活,则是T2DM的一个显著特征。大量研究表明,O-GlcNAc糖基化修饰(O-GlcNAcylation,O-GlcNAc)可作为营养感受器参与多种代谢过程,尤其和糖代谢异常的关系极为密切。前期已证实,叉头框转录因子(Forkhead box protein O1,FoxO1)作为糖异生关键转录因子,受到O-GlcNAc糖基转移酶(O-GlcNAc transferase,OGT)的调控。但是,由OGA所介导的O-GlcNAc去糖基化对FoxO1的作用和分子机制尚待研究证实。研究方法:在表型研究方面,利用慢病毒感染方法,构建人正常肝细胞OGA过表达和敲减的细胞系模型,并通过qPCR和Western blot等实验方法验证过表达OGA对肝脏糖异生的影响。在机制研究方面,(1)通过小干扰RNA(siRNA)实验观察OGA对FoxO1转录活性的影响;(2)通过免疫共沉淀实验研究OGA和FoxO1间的相互作用;(3)通过免疫荧光方法研究OGA对FoxO1细胞核转位的调控;(4)通过蛋白质半衰期实验,研究OGA对FoxO1蛋白稳定性的影响;(5)通过PI3K/Akt抑制剂处理,研究胰岛素通路对OGA调控FoxO1的影响;(6)通过AMPK抑制剂和siRNA小干扰实验,研究AMPK途径对OGA调控FoxO1的影响。结果:1.成功构建人正常肝细胞OGA过表达和敲减细胞系模型;2.过表达OGA可通过下调FoxO1蛋白表达,抑制肝脏糖异生的过度激活;3.OGA可直接和FoxO1发生相互作用,并上调FoxO1的O-GlcNAc糖基化水平;4.OGA负调控FoxO1不影响其核转位;5.过表达OGA促进FoxO1降解,降低FoxO1蛋白稳定性;6.OGA负向调控FoxO1活性,不依赖于胰岛素及AMPK通路的磷酸化调控。结论:O-GlcNAc水解酶和FoxO1相互作用,通过降低FoxO1蛋白稳定性下调其蛋白表达,抑制FoxO1转录激活糖异生关键基因表达,本研究或有望为糖尿病的预防提供一个新的研究思路。