背景与目的:胃癌全球发病率位居第五位,病死率位居第三。我国胃癌高发,严重威胁国人的健康。早期胃癌的术后生存率明显高于进展期胃癌,但我国早期胃癌的诊断率不超过10%。胃镜加活组织检查是目前诊断胃癌的主要手段,但因其有创性和高费用难以成为胃癌筛查性诊断方法。血清标志物是肿瘤筛查的简便方法,但胃癌目前无临床可用的标志物。随着血清蛋白组学的发展,一些具有潜在诊断价值的胃癌血清新标志物相继被报道,尽管临床鲜有应用,但为寻找胃癌血清标志物带来了希望。适配子是通过体外指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选得到的人工寡核酸配体,识别能力类似抗体,但稳定性、可修饰性等方面优于抗体,在分子诊断方面有良好的应用前景。利用适配子捕获和分析其血清靶蛋白成为寻找肿瘤标志物的新途径。我们前期以胃癌血清为靶标,成功筛选出86个胃癌血清适配子。本研究将在前期工作基础上,应用本课题组建立的适配子三重血清荧光法对这些适配子的诊断价值进行评价,对诊断价值大的适配子进行其血清靶蛋白捕获和质谱分析,寻找胃癌血清中的差异表达靶蛋白,旨在发现有诊断价值的胃癌新血清标志物。方法:1、血清标本收集:收集2013~2016年间在南昌大学第一附属医院住院的胃癌、良性胃病患者治疗前的血清标本及其相关临床资料,并同期收集检查结果未见异常的健康体检者的血清标本及资料。2、适配子的诊断价值评价:采用前期建立的适配子三重血清荧光法检测32例胃癌、良性胃病和正常对照血清标本在不同检测温度下(8~oC、25 ~oC、37 ~oC和42~oC)的血清自体荧光值、加入核酸染料OliGreen后的荧光值及再加入适配子作用后的荧光值。根据受试者工作特征曲线下面积(AUROC)评价单项荧光指标和多项荧光指标(Logistic回归分析建模)对胃癌的诊断价值,选择诊断价值大的适配子用胃癌、良性胃病和正常血清标本各64例进一步验证其诊断价值。对诊断价值得到确认的适配子进行大样本诊断价值评估。采用主成分分析结合Logistic回归、人工神经网络或决策树建立诊断模型,评价适配子联合分析对胃癌的诊断价值。3、适配子血清靶蛋白的捕获:(1)5’端生物素标记对胃癌诊断价值大的适配子。将梯度浓度的适配子与固定量的链霉亲和素化磁珠混合孵育,磁分离后取反应液残液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色,以确定适配子-磁珠结合的最佳比例;(2)将固定量的适配子与梯度量的混合血清孵育,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和GelRed染色,以确定适配子与血清结合的最佳比例;(3)将适配子与血清标本孵育,然后加入链霉亲和素磁珠孵育,磁选分离并弱碱洗脱回收捕获蛋白,SDS-PAGE和银染色初步鉴定捕获蛋白。4、捕获靶蛋白的质谱分析:将各适配子在胃癌混合血清和正常混合血清中捕获的靶蛋白冻干浓缩,然后送生物公司进行液相串联质谱(LC-MS/MS)分析,并采用Label free方法对所鉴定出的蛋白质进行定量。5、MRM分析差异表达靶蛋白在血清标本中的表达水平:根据质谱分析结果,筛选出胃癌特有或在两组间表达量差异在3倍以上的蛋白质,查阅文献找出胃癌或肿瘤相关蛋白作为目标靶蛋白。将胃癌和对照(正常、良性胃病、良性胃肿瘤)血清标本送生物公司进行MRM定量质谱分析,检测各目标蛋白在不同血清标本中的表达水平,评价其对胃癌的诊断价值。结果:1、研究对象:胃癌236例,其中男167例,女69例,平均年龄59.7岁。良性胃病170例,其中男58例,女112例,平均年龄53.0岁。正常对照184例,其中男74例,女110例,平均年龄48.7岁。2、适配子的诊断价值评价:小样本分析显示86个适配子中有17个适配子单指标的最佳AUROC接近或者大于0.8,多指标联合能进一步提高诊断价值,有些适配子的AUROC≥0.9。扩大样本至64例验证上述17个适配子的胃癌诊断价值,挑选出仍对胃癌诊断价值大的7个适配子(AP-GCS-9-5、AP-GCS-9-15、AP-GCS-9-21、AP-GCS-15-16、AP-GCS-15-36、AP-GCS-17-25、AP-GCS-18-7)进行590例血清标本分析,结果显示大多数荧光指标在胃癌、良性胃病和正常对照3组间差异具有统计学意义,单项荧光指标诊断胃癌的AUROC为0.59~0.74。根据主成分概率建立的Logistic回归、决策树以及神经网络诊断模型均能提高适配子的诊断价值,尤其是神经网络模型,其区分胃癌与正常对照的AUROC达0.902~0.945;区分胃癌与良性胃病的AUROC达0.890~0.944;区分胃癌与全部非胃癌的AUROC达0.855~0.924。7个适配子联合分析能明显提高诊断价值,区分胃癌与正常血清的敏感度、特异度分别为100%和99.5%;区分胃癌与良性胃病的敏感度和特异度高达100%;区分胃癌与合部非胃癌的敏感度、特异度分别为97.5%和97.7%。3、适配子血清靶蛋白的捕获及质谱分析:以7个适配子(AP-GCS-9-5、AP-GCS-9-15、AP-GCS-9-21、AP-GCS-15-16、AP-GCS-15-36、AP-GCS-17-25、AP-GCS-18-7)为捕获分子,在胃癌血清/正常血清中分别捕获蛋白44/46、80/75、61/64、114/101、52/59、79/89、79/68个,共有165个蛋白在胃癌和正常血清中表达有差异,据文献报道其中与肿瘤相关的蛋白93个。4、目标蛋白MRM定量检测结果:从上述93个差异表达蛋白中选出40个可能与胃癌关系最密切的蛋白进行MRM质谱分析,其中16个蛋白被成功检测,分析它们在胃癌(n=120)和对照血清标本(正常、良性胃病、良性胃肿瘤各60例)中的表达情况,单因素方差分析结果提示有11个蛋白在组间的表达具有统计学差异,但是单指标区分胃癌与非胃癌的AUROC只有0.56-0.66.根据特征选择节点,挑选出7个预测变量(vWF,A1AT,haptoglobin,ALS,ATIII,THBS-1和C1 Inh)用于构建C5.0决策树模型。该模型预判胃癌、良性胃肿瘤、良性胃病和正常的准确性分别为92.5%(111/120)、85.0%(51/60)、83.3%(50/60)、96.7%(58/60)。此外该模型对早期胃癌的准确性达81.8%(18/22)。结论:1、通过临床血清标本筛选、验证和评价分析,证实前期筛选出的86胃癌血清适配子中有7个对胃癌有良好的诊断价值,特别是通过神经网络诊断模型进行联合分析,表明成功优选出一组具有良好诊断价值的胃癌血清适配子。2、对上述7个适配子在胃癌和对照血清中的靶蛋白进行了捕获及质谱分析,发现了165个胃癌血清中差异表达的靶蛋白,其中文献报道与肿瘤相关者93个,提示其中可能存在潜在的胃癌血清标志物。3、通过MRM定量质谱技术选择性分析了16个靶蛋白在胃癌和对照血清标本中的表达水平,发现11个差异表达蛋白。应用其中7个蛋白构建的C5.0决策树模型对胃癌具有良好的诊断价值,提示可能是潜在的胃癌新血清标志物。