穿心莲是一具有国际代表性的重要药用植物,在中国、印度、马来西亚等国家具有悠久的民间药用史,用于防治上呼吸道感染、胃肠及肝胆疾病,且被广泛、大量地应用于国内外制药行业。穿心莲是广东省特色中药材之一,以穿心莲为主要组成药物的消炎利胆片即是广东省名优产品。近年来,关于穿心莲内酯类成分治疗肺炎、肝炎、结肠癌、呼吸道感染、糖尿病和艾滋病等药理研究报导越来越多,穿心莲药材在国内外的需求量与日俱增,迫切需要优质高产稳定的药材供应。为保证穿心莲药用植物资源的可持续发展和利用,有必要对目前我国穿心莲药用植物资源进行详细调查,并对其进行种质资源研究和质量评价,探索穿心莲优良种质培育途径,完善穿心莲种质资源质量评价方法；另一方面,是将传统种质资源研究方法与现代科学研究相结合的有益尝试,为高产优质穿心莲的培育和中药资源的开发利用研究提供了一些新的想法和思路。主要研究内容概述如下：一、穿心莲种质资源调查研究(一)穿心莲种质资源分布、生物学特性及产销情况调查对广东、福建、广西、四川及云南的穿心莲种质资源进行了生物学特性、资源蕴藏量及产销情况等多方面的调查,并收集了大量样品。在实地调查中发现目前仅在云南文山、福建泉州有极少野生资源分布,多为单株生长于人迹罕至的森林中,但由于气候以及人为因素,已近乎灭绝,此外便是零星分布的半野生穿心莲。目前栽培穿心莲主要分布在广东省湛江市和清远市、福建省漳州市、广西省贵港市和南宁市、四川省宜宾市,穿心莲在这四省的栽培面积分别约为5000亩、4000亩、6万亩、2000亩,以广西省种植面积最大,而且广西有专门的种子田,四川和广东所用穿心莲种子均来源于广西,而云南自2010年后已无种植。栽培穿心莲多采用单作或套种,采收加工方法随意,多是当地药商或药企直接收购穿心莲干燥地上部分或叶、茎、根部位,收购价2～8元。不同产地的穿心莲其形态特征存在较大差别,叶片大小、花径大小、株高等是主要的形态多样性指标。(二)穿心莲种质资源数据库信息系统构建以“西南野生生物种质资源库”和“南药种质资源数据库”为参考,建立了穿心莲种质资源数据库信息系统,在Windows环境下构建数据管理平台,详细载入了穿心莲的资源分布、蕴藏量、生境、生物学特性,以及不同产地穿心莲种质资源原植物、标本及其化学指纹图谱等图片信息,从而利于穿心莲种质资源信息的实时更新以及资源保护。二、穿心莲种质资源遗传多样性研究(一)基于6种同工酶的穿心莲种质资源遗传多样性研究采用过氧化物酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、细胞色素氧化酶、酯酶、过氧化氢酶电泳技术,对3份野生穿心莲种质资源和27份栽培穿心莲的遗传多样性进行分析。结果显示,6种同工酶共检测到24条稳定酶带,其中1条为特异酶带,出现在福建省泉州野生穿心莲多酚氧化酶酶谱中。上述6种同工酶的多肽位点百分率分别为75.00%、40.00%、57.14%、0.00%、33.33%和66.66%。30份穿心莲材料间的相似系数介于0.708～1.000,平均值为0.863,遗传距离介于0.000～0.197,平均遗传距离为0.087,福建泉州野生穿心莲与栽培品种间的相似系数相对较小,遗传距离较大,其它穿心莲种质资源间的相似系数较大,遗传距离较小。聚类分析表明在相似系数为0.795处可将30份穿心莲材料聚为3类,第1类由福建泉州野生穿心莲组成；第Ⅱ类由广东湛江市遂溪县栽培穿心莲组成；剩余的23份穿心莲材料聚为第Ⅲ类,其在相似系数为0.848处聚为3个亚类。主成分分析将30份穿心莲材料分成10个彼此孤立的成分,且其分布位置较近。结果表明30份不同产地穿心莲种质资源的遗传多样性水平极低,其中福建泉州野生穿心莲与栽培穿心莲间的亲缘关系相对较远。(二)穿心莲叶绿体基因组序列测定及主要基因片段的比较分析通过双向延伸叶绿体的两个保守基因获得叶绿体基因组骨架序列再对其碱基进行校正以获得最终序列的方法获得穿心莲叶绿体基因组序列,为爵床科第一条叶绿体基因组序列。穿心莲的叶绿体基因组全长150249 bp,含38.3%GC,呈典型四段式结构,编码132个基因,去除重复后为114个,包括80个蛋白编码、30个tRNA和4个rRNA基因,在穿心莲叶绿体蛋白编码基因中matK基因的序列变异最大。在穿心莲的叶绿体基因组中共检测到4对正向、5对反向、7条串联重复序列和154个SSR位点。基于33个物种的简单重复序列(SSR)分析发现这些物种的SSR绝大多数为连续A或连续T,在叶绿体基因组内呈不均一分布。比较基因组研究表明穿心莲与其它三个唇形目物种的叶绿体基因组之间整体相似性较好,基因间区的变异最大。序列变异分析发现了菊分支10个变异最大的基因和10个最保守的基因,其中matK是平均遗传距离最大的基因,可以作为穿心莲最好的遗传标记。经比较,不同产地穿心莲的叶绿体基因序列间没有差别,这从叶绿体基因角度说明不同产地穿心莲种质资源的遗传多样性水平较低。基于73个叶绿体蛋白编码基因的系统进化研究表明穿心莲在现有叶绿体基因组公布的菊分支物种中与丹参关系最近。三、环境因子对穿心莲生物学特性影响的研究(一)土壤理化性质对穿心莲质量性状的影响对穿心莲不同产地的土壤因子进行深入研究,发现中性偏弱酸性土壤较为适宜穿心莲的生长,而土壤质地以红壤为好。同时对不同产地间土壤中所含大量元素对穿心莲质量性状的影响进行研究,通过相关性分析和通径分析可以看出土壤理化性质对穿心莲质量性状影响较大,土壤pH及所含的氮、磷、钾、有机质等与穿心莲中所含总内酯、总黄酮、醇溶性浸出物含量均有一定的相关性。其中速效磷是直接影响穿心莲总内酯含量的重要元素,提示适当增施磷肥,可以提高穿心莲的质量。同时由于有机质与总黄酮也有极显著正相关,且其对总黄酮的间接作用最大,表明在穿心莲种植中可以通过实施有机肥影响土壤中其它成分的含量以提高穿心莲质量,为穿心莲规范化种植提供了参考。(二)肥料对穿心莲生长、同工酶及药效成分含量的影响采用单因子随机设计将盆栽植株分为空白、有机肥、化肥、微肥4个处理组,根据文献报道对营养生长期的穿心莲进行根部施肥,至花期采收,测定植株株高、分枝数、叶片数、单株鲜重等生长参数,对不同肥料处理后穿心莲叶、茎、根中的过氧化物酶、酯酶同工酶进行电泳分析,并测定不同肥料组穿心莲叶中穿心莲内酯类成分的含量。结果显示有机肥组的穿心莲植株鲜重和干重最大,微肥次之；施肥后穿心莲过氧化物酶和酯酶同工酶酶活性较空白增高,且化肥组穿心莲根部过氧化物酶和叶中酯酶活性最高；施肥后穿心莲叶中有效成分含量增高,微肥组穿心莲中穿心莲内酯的含量增高最多,为39%,化肥和有机肥组分别为26%、15%,而化肥组穿心莲中脱水穿心莲内酯的含量升高最多,为85%,有机肥和微肥组分别为82%、39%。研究结果说明有机肥对穿心莲的生长性状影响较大且有利于脱水穿心莲内酯的生成,微肥有利于穿心莲内酯的积累,肥料的施用可以加强穿心莲的生理生化水平,因此可以通过配施有机肥和微肥提高穿心莲的产量和质量,同时达到环保效果。(三)不同生长期穿心莲叶中6种同工酶的变化通过对不同生长期穿心莲叶中过氧化物酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、酯酶6种同工酶酶谱进行电泳测定,分析其在不同生长期的变化规律。结果表明穿心莲叶中的上述6种同工酶均有各自的特征酶带,酶活性均在花果期明显增高,其中过氧化物酶和多酚氧化酶还产生了新的酶带,说明花果期穿心莲植株保护酶活性的升高与其生理作用水平的提高协调一致,而酶活性的增高和特征酶带的产生有利于调节其对环境适应性的代谢过程,从而顺利度过生长转型期,同时保护植株免受有害物质损伤,从而使细胞内具备大量剩余能量进行次生代谢产物的积累。(四)盐胁迫对穿心莲生长、生理及次生代谢产物的影响通过设置空白和四个盐度4 dSm-1、8 dSm-1、12 dSm-1、16 dSm-1处理组,对长势一致的穿心莲幼苗处理15天后,分析不同盐浓度条件下穿心莲的生长、同工酶及代谢产物变化情况。结果显示12 dSm-1是穿心莲可以耐受的盐度阈值；随着盐浓度的增加,穿心莲的生长会受到抑制,过高时植株会出现叶片卷曲、枯萎甚至脱落的现象,但低于盐阈值时,穿心莲的生长受限情况不明显；随着盐度的增大,穿心莲叶和根中的抗氧化酶(过氧化物酶、超氧化物歧化酶、细胞色素氧化酶、多酚氧化酶、过氧化氢酶)和酯酶酶活性增强,且不同部位同工酶的表现不同；作为评价作物细胞膜受损程度的丙二醛含量逐渐增高,但当盐浓度过高时,缓解细胞受损的脯氨酸含量会急剧升高以保护植株生长；在阈值范围内,穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯及去氧穿心莲内酯的含量随着盐度的增加而增多。说明穿心莲具有一定耐盐性,且适当的盐处理有利于穿心莲内酯类化学成分的积累,可以培育具有抗盐性且有效成分含量高的穿心莲种质。此外,穿心莲可以作为一种耐盐作物在盐碱地中进行推广种植,扩大穿心莲种质资源分布面积的同时有效利用土地资源。在盐胁迫环境中,穿心莲会通过自我调节不同部位酶活性、生成代谢产物等来适应逆境；当胁迫损害加强时,为了达到物质和能量的恒定状态,穿心莲会通过提高酶活性、脯氨酸含量及次生代谢产物含量来维持植株正常生长,但次生代谢产物的生成是一个能量大量损失的过程,因此当盐胁迫导致的氧化应激危害进一步加强时,穿心莲开始减少次生代谢产物的生成,转而大量生成具有保护性的小分子物质脯氨酸,从而减轻细胞膜的受损程度。(五)甜菜碱对穿心莲盐胁迫损伤的缓解作用为了缓解高浓度盐处理时穿心莲的生长抑制现象,将5mM甘氨酸甜菜碱加入到盐溶液中再对穿心莲进行处理,至花期采收样品,测定生长参数、穿心莲叶、茎、根中的抗氧化酶活性,以及叶和茎中穿心莲内酯的含量。结果显示甜菜碱可以缓解盐胁迫所导致的氧化应激损害,盐度超过阈值时穿心莲未出现叶片卷曲、掉落现象,抗氧化酶活性保持一致,叶和茎中穿心莲内酯的含量随着盐度的增高而升高,而且延长盐处理时间后也未出现不良情况。因此,外源甜菜碱可以很好地缓解盐胁迫对穿心莲的生长抑制作用,同时保证关键药效成分穿心莲内酯的含量提高。(六)水分胁迫对穿心莲生长、同工酶及主要药效成分的影响采用盆栽试验,单因素随机设计法设置土壤相对含水量100%、40%、20%三个组,1000%为对照,于营养生长期进行水分胁迫,待其长至花期采收样品,测定生长参数,穿心莲叶、茎、根过氧化物酶(POD)和酯酶(EST)同工酶以及叶中穿心莲内酯类成分的含量。结果表明水分胁迫下穿心莲生长相对缓慢,叶片内的POD酶活性和茎中的EST酶活性明显降低,根内POD和EST酶活性几乎无变化；40%水分胁迫时叶中穿心莲内酯的含量较100%升高了30%,胁迫加重时含量下降,而脱水穿心莲内酯、新穿心莲内酯和去氧穿心莲内酯在水分胁迫条件下含量均明显下降。说明穿心莲在水分胁迫下会消耗大量能量维持正常生长,生理酶活性降低,药效成分生物合成能力减弱；40%水分胁迫时穿心莲内酯含量的升高可能是抵御环境胁迫的应激反应表现。因此穿心莲的耐旱性较弱,湿润环境有利于优质穿心莲种质资源的培育和生产。四、穿心莲种质资源的质量评价(一)穿心莲种质资源的高效薄层色谱研究研究穿心莲高效薄层色谱测定分析方法,对包括14批不同产地穿心莲种质、14批商品药材、不同部位以及不同干燥品进行了HPTLC指纹图谱研究,以硅胶GF254高效预制薄层板,以氯仿-甲苯-甲醇(80：1O：15)为展开剂,5%硫酸乙醇溶液显色后,获得穿心莲二萜内酯类化学成分的薄层荧光色谱指纹图谱,经指纹图谱系统解决方案软件(CHROMA 1.5)生成共有模式。穿心莲二萜内酯类化学成分的薄层色谱图由12个特征荧光斑点组成,HPTLC指纹图谱共有模式含有9个特征峰,相似度分析表明不同商品药材的相似度存在较大差异。对比叶、茎、根的模式图,发现商品药材与茎的吻合度最高。HPTLC色谱图不能较好地显示不同穿心莲种质资源间的差异。以鲜品为对照,利用HPTLC方法考察不同干燥方法(包括阴干、晒干、烘干(60℃)、冻干、微波干燥)对穿心莲叶中穿心莲内酯类化学成分的影响,结果表明干燥后的穿心莲叶中含有的成分种类和数量均较鲜品多。以氯仿-甲苯-甲醇(70：10：15)为展开剂,10%三氯化锑氯仿溶液显色后,获得穿心莲根中黄酮类化学成分的薄层色谱直观图谱,由7个鲜亮的黄色斑点组成(日光下),方法重复性良好,可为后期穿心莲黄酮类化学成分的相关研究奠定基础。因此,利用HPTLC可以对穿心莲进行质量评价,快速有效区分穿心莲不同质量级药材。(二)穿心莲种质资源的高效液相色谱研究1.穿心莲内酯类化学成分的HPLC指纹图谱研究对30个不同产地的穿心莲种质进行高效液相色谱指纹图谱研究,并以广东省湛江市遂溪县城月镇的栽培穿心莲为标准药材,选取穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯四个色谱峰进行多点校正,建立了更具代表性、更加丰富的指纹图谱共有模式图,含有20个共有峰,分离度良好,重现性佳。相似度分析结果显示,不同产地穿心莲种质与对照穿心莲间的相似系数介于0.331～0.995,变化范围较大,说明不同产地穿心莲种质资源间存在明显的化学成分表型多样性。该HPLC方法可以很好地对不同种质穿心莲进行质量评价。2.穿心莲内酯等4种主要成分的含量测定以穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和去氧穿心莲内酯作为含量测定指标,分别对不同产地穿心莲种质资源叶、茎中所含上述四个成分的含量进行测定比较。结果显示不同产地穿心莲叶、茎中含量差别迥异,且叶中的含量差异程度较茎中显著,说明不同产地穿心莲的质量差异主要表现在叶部位。经比较广东产穿心莲所含穿心莲内酯类成分含量最高,穿心莲内酯含量高达54.7 mg·g-,总内酯高达82.7mg·g-,因此广东穿心莲种质资源质量最佳,同时说明可在广东进行穿心莲规范化种植推广。光照充足时穿心莲总内酯在叶中含量较高,而完全背阴时穿心莲总内酯在茎中含量较高,说明光照是影响穿心莲种质质量的关键因素之一,是穿心莲化学表型多样性形成的主要因素。分别于一天内8：00,11：00,14：00,17：00,20：00采集同一植株的叶片,测定四个成分的含量变化。结果发现穿心莲内酯等成分的含量在8：00至17：00这段时间内有升降波动,在17：00到20：00时持续升高,说明光照有利于穿心莲内酯等药效成分的生物合成。3.溶媒对穿心莲内酯类化学成分稳定性的影响利用HPLC法检测不同溶媒提取液在放置过程中5个主要成分的含量变化,探讨溶媒对其化学稳定性的影响。结果显示甲醇、乙醇及其醇水混合溶媒对5个化学成分的提取率较高,但是随着溶媒极性的增大其化学稳定性降低；常温条件下,以甲醇为溶媒,穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和去氧穿心莲内酯在放置过程中含量会升高,但3天后开始下降,在HPLC图谱中显示峰较明显的X1和X2成分则一直下降；在甲醇水溶液中,五个指标成分的含量一直下降；在乙醇、85%EtOH中,五个指标成分3天内均较稳定。85%乙醇提取液高温处理后,穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量均升高,2h后仅脱水穿心莲内酯仍升高,而X1和X2一直减少：低温放置过程中,各成分基本保持不变。85%乙醇为实现穿心莲内酯类成分较高提取率、稳定、环保的最佳溶媒；放置过程中,穿心莲内酯的含量下降并不是转化为脱水穿心莲导致的,还有其它成分参与的复杂转变和转化；穿心莲内酯类成分分析过程中应注意溶媒的选择,且不宜长时间放置；生产过程中应该对其环境温度进行随时监测,尽量控制在低温状态下。(三)不同产地穿心莲中重金属及农残检测1.电感耦合等离子体质谱法同时测定不同产地穿心莲药材中19种金属元素含量建立应用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定穿心莲药材中19种微量元素(包括钠、镁、铝、硅、钾、钛、铬、锰、铁、钻、镍、铜、锌、砷、银、镉、锡、汞、铅)含量的测定方法。样品经微波消化后直接采用八极杆碰撞/反应池技术结合电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)进行测定。结果显示测定方法中所有元素的线性相关系数(r)都大于0.9990,检出限在0.001～0.051 μg·kg-1之间,重复性和稳定性的相对标准偏差(RSD)都小于10%,药材的加标回收率在88.64%～102.98%之间,符合痕量分析的要求。本方法检出限低、操作简单、快速,且灵敏度高,可作为穿心莲药材中微量元素的定量分析。2.气相色谱-电子捕获检测器(GC-63Ni-ECD)法测定穿心莲药材中22种农药残留采用GC-ECD法建立药材中16种有机氯和6种拟除虫菊酯类农药残留量的同时测定方法。用弗罗里硅土萃取净化样品后,GC-ECD测定,ZB-1701P弹性石英毛细管柱程序升温分离,载气为高纯N2,柱流量1.45 mL · min-1,不分流进样1μL。弗罗里硅土固相萃取能有效净化药材样品中杂质,检测限为0.1～3.0μg·kg-1,平均回收率为82.31～120.01%(RSD 0.68～3.41%,n=6)。所建立的方法能同时测定药材中22种有机氯和拟除虫菊酯类农药残留量,方法灵敏度高,通用性强,可作为药材的常规检验方法。