论文部分内容阅读
DNA聚合酶d(DNA polymerase delta, Pold)是真核生物DNA复制过程中主要的复制酶之一,在DNA复制、损伤修复方面起着重要的作用。Pold由POLD1基因编码,其p125催化亚基上具有聚合酶活性和外切酶活性。研究发现,POLD1基因异常表达与肿瘤的发生和发展有着直接的关系,但POLD1与肿瘤迁移相关性的作用并不清楚。本研究采用小RNA干扰(small RNA interfering)技术,靶向敲低HeLa、HUVEC和Chang Liver细胞中POLD1基因的表达,检测了POLD1-siRNA对HeLa、HUVEC、Chang Liver3株细胞骨架分布的影响,初步探讨了POLD1-siRNA诱导HeLa、HUVEC. Chang Liver3株细胞骨架与细胞迁移的相关性。实验方法：1.设计合成针对人POLD1基因的2条siRNA序列(POLD1-siRNAl、2).取对数生长期细胞用于实验,采用MTT法检测POLD1-siRNA对细胞活力的影响；划痕实验检测细胞迁移能力。2. POLDl-siRNA转染细胞72h后,倒置显微镜观察活细胞形态。3.免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察细胞骨架中微管、微丝和中间丝及其相关蛋白a-Tubulin、γ-Tubulin. F-actin、Cortactin、FilaminA、Vimentin、LaminB等在细胞中的分布及表达量。4.免疫荧光染色观察黏着斑相关蛋白Paxillin、FAK、Src在细胞中的分布及表达量。5.免疫荧光染色观察细胞迁移中信号蛋白p125、Rho、Cdc42等在细胞的分布及表达量,Western Blot技术检测p125、β-actin等蛋白表达量。实验结果：1. POLD1-siRNAl转染HeLa、HUVEC和Chang Liver细胞72h后,对HeLa、 HUVEC细胞的抑制率分别为11.38%、12.11%,与对照组相比,细胞的活力显著下降p<0.05)；对Chang Liver细胞的抑制率为21.32%,细胞活力极显著下降(p<0.01)。POLD1-siRNA2转染HeLa, HUVEC和Chang Liver细胞后,对HeLa细胞的抑制率为17.85%,细胞活力极显著降低(p<0.01)；但对HUVEC和Chang Liver细胞活力没有显著性差异(p>0.05)。2.划痕实验显示：与对照组相比,POLD1-siRNA转染细胞后,在48h前抑制HeLa细胞迁移,48h后抑制能力减弱,有促进迁移的趋势；HUVEC细胞的划痕修复速度加快,迁移能力增强；而Chang Liver细胞的划痕修复能力明显减慢,迁移能力下降。3. POLD1-siRNAl转染HeLa、HUVEC细胞72h后,细胞呈瘦长型,微管呈束状,不对称分布,细胞迁移前缘中微管结构稳定,数量增多,决定细胞迁移的方向。细胞膜处微丝聚集、延伸,使细胞膜表面突起,形成丝状伪足、片状伪足,诱导细胞迁移。高表达的Vimentin是细胞迁移的标志,本实验研究结果显示Vimentin的表达量增加,促进细胞迁移。但POLD1-siRNAl转染Chang Liver细胞72h后,细胞中微管为致密的网状结构,微丝解聚呈弥散状,Vimentin的表达量显著下降,抑制细胞迁移。POLD1-siRNA2转染HeLa、HUVEC细胞72h后,细胞呈不规则形状,出现丝状伪足和片状伪足,微管集中分布于细胞前缘,细胞质中的微丝解聚,细胞膜处微丝聚合,诱导细胞迁移。Vimentin在HUVEC细胞中表达量增加,促进HUVEC细胞迁移。但POLD1-siRNA2转染Chang Liver细胞72h后,细胞边缘出现片状伪足,但细胞质和细胞膜处微丝解聚,含量降低,同时Vimentin的含量极显著下降,抑制细胞迁移。4. POLD1-siRNAl转染HeLa、HUVEC细胞72h后,两株细胞中FAK、Src的表达量升高,激活的FAK-Src复合物使Paxillin磷酸化,促进细胞迁移,同时HeLa细胞中FAK激活后进入细胞核中参与细胞迁移活动的调节。POLD1-siRNA2转染HeLa、HUVEC细胞72h后,FAK、Src在两株细胞中的含量显著增加,促进细胞迁移。但FAK在HUVEC细胞的含量降低,说明POLD1-siRNA2转染HUVEC细胞没有激活FAK。5. POLD1-siRNAl转染HeLa、HUVEC细胞72h后,两株细胞中Rho的表达量都增加,调节应力纤维和片状伪足的形成,同时HeLa细胞中激活的Rho进入细胞核,共同促进细胞迁移。POLD1-siRNAl转染Chang Liver细胞72h后,细胞中Rho的含量降低,抑制细胞迁移。POLD1-siRNA2转染HeLa细胞72h后,Rho表达量增加、活化,促进细胞迁移。在HUVEC细胞中Rho的表达量降低,可能Rho没参与细胞迁移的调节。但Chang Liver细胞中Rho的含量显著下降,抑制细胞迁移。结论：POLD1-siRNAl能够使细胞中FAK和Src的含量增加,从而激活FAK-Src复合物的活性,同时Paxillin蛋白被磷酸化,进而调节HeLa、HUVEC细胞前缘黏着能力增强,细胞后缘黏着斑与细胞外基质去黏附,诱导细胞迁移。POLD1-siRNA2处理HeLa和HUVEC细胞后,仅HeLa细胞是通过FAK-Src通路激活,促进细胞迁移。HUVEC细胞中FAK表达量下降未活化。POLD1-siRNAl通过小G蛋白Rho调节细胞HeLa、HUVEC细胞中应力纤维聚合、丝状伪足、片状伪足的形成,最终促进细胞迁移。POLDl-siRNA2处理HeLa和HUVEC细胞后,仅HeLa细胞中Rho小G蛋白活化,促进细胞迁移。HUVEC细胞中Rho表达量下降未活化。综上所述：POLD1-siRNA转染细胞后,细胞可能通过FAK-Src通路促进细胞迁移、Rho小G蛋白促进细胞迁移或者两者共同作用促进细胞迁移。