论文部分内容阅读
乳糖酶，即β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶（β-D-galactoside galactohydrase EC3.2.1.23），具有催化乳糖水解生成半乳糖和葡萄糖和一定的转糖基活性，在食品、医药和分析化学等领域都有重要应用。低温乳糖酶是指在低温下有较高的催化活性的乳糖酶。乳品加工大部分操作都是在低温（4°C左右）进行，低温乳糖酶适于在低温水解牛乳中的乳糖，对产品的品质影响较小，在乳品加工业具有很好的应用前景，所以近年来已经成为乳糖酶的研究热点。本研究以从新疆天山冻土筛选低温乳糖酶产生菌株为出发点，对其进行诱变选育、产酶条件优化，得到适合在低温下水解乳糖的乳糖酶，并对其酶学性质进行了研究。通过三级筛选，从新疆天山冻土中分离筛选到一株产低温乳糖酶的耐冷菌，其产酶能力达到3.01U/mL。该菌株产生的低温乳糖酶为胞内酶。根据形态观察、生理生化试验、16S rDNA基因序列同源性比对及构建系统发育树对该菌株进行了鉴定。结果显示，该菌株属于拉恩氏菌属（Rahnella sp.），因此命名为Rahnella sp.R3。采用紫外线和亚硝酸复合处理对Rahnella sp.R3进行诱变。结果显示，最佳复合诱变条件为：先用30W的紫外线照射100s，筛选出诱变效果好的菌株UV-14，然后再用0.1mol/L的亚硝酸处理UV-14菌株100s，筛选到产酶量最高的一株突变菌株UN-9。UN-9产低温乳糖酶的活力达到4.06U/mL，比出发菌株提高了35%。经十次传代培养，该菌株表现出良好的遗传稳定性，相对酶活均在98%以上。通过单因素实验和正交实验对UN-9进行了摇瓶产酶条件研究，确定其最佳培养基组成为：乳糖40g/L、蛋白胨20g/L、酵母浸膏12g/L、硫酸镁2g/L；最佳发酵条件为：种龄24h、装液量为50ml/250ml（三角瓶）、接种量为4%、培养基初始pH7.0±0.2、15°C、200rpm、培养32h。在最佳发酵工艺条件下，测得酶活为4.45U/mL。采用硫酸铵分步沉淀法对UN-9所产低温乳糖酶进行了初步纯化和酶学性质研究。结果表明，该酶的最适作用温度为25°C，15°C时的酶活为最高酶活的92%，4°C时的酶活为最高酶活的31%。该酶对热敏感，在65°C保温1h酶活力完全丧失。该酶的最适pH为7.0，在pH6.59.0范围内显示良好的稳定性。一些金属离子对该乳糖酶的活性有一定的影响，Cu2+、Al3+、Zn2+对该酶有明显的抑制作用，Na+、Ca2+等对酶活性影响很小。菌株UN-9所产低温乳糖酶应用于牛乳中进行乳糖水解率的研究。结果表明，在25°C反应2.5h，乳糖水解率达到82%。