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目的:(1)观察脂质体介导Rho-ROCKⅡ特异抑制性小分子多肽转染大鼠背根节神经元(DRGNs)可行性及其转染效率；(2)观察Rho-ROCKⅡ特异性抑制的小分子多肽对大鼠背根节神经轴突再生和延长的影响。(3)对比Rho—ROCKⅡ特异性抑制剂Y27632与Rho-ROCKⅡ特异抑制性小分子多肽对大鼠背根节神经轴突再生和延长的影响。
方法:(1)随机选取符合条件的健康雌性SD成年大鼠10只,按WD法制成SD大鼠T9平面完全性截瘫的脊髓损伤动物模型,完成造模7d后取T8-10节段脊髓制备脊髓提取液。(2)新生SD大鼠(<5d)DRGNs分离、培养、鉴定、纯化、扩增。(3)观察最高转染率条件下,不同脂质体／多肽浓度对DRGNs神经轴突长度、TubulinβⅢ阳性表达以及轴突远端平均荧光密度的影响。(4)瘫痪脊髓提取液+DRGNs分别与脂质体／多肽和Y26732共同培养,观察对DRGNs神经轴突长度、TubulinβⅢ阳性表达以及轴突远端平均荧光密度的影响。
结果:(1)转染后2天,不同脂质体／多肽浓度下,每组测量60个轴突长度均数为:A组(1ug多肽+2.5μl脂质体)为197±14um,B组(2ug多肽+5μl脂质体)为301±17um,C组(4ug多肽+10μl脂质体)为316±25um,D组(8ug多肽+20μl脂质体)为367±29um,E组(10ug多肽+20μl脂质体)为265±16um,F组(12ug多肽+30μl脂质体)为291±21um。差异有统计学意义,D组最长,两两分析D组与其它组均有统计学差异(P<0.05)；各组TubulinβⅢ免疫荧光强度均值:A—F组分别为197.8±20.1,231.8±19.1,249.8±22.8,289.1±17.1,269.8±21.6,271.6±16.2AFU／um；其中D组(使用8ug多肽+20μl脂质体)轴突远端平均荧光密度高于其它各组,但各组间无统计学意义(P>0.05),各组神经轴突干均有细长生长锥形成,神经轴突延伸,神经轴突干TubulinβⅢ浓聚,生长锥增粗。(2)瘫痪脊髓提取液+DRGNs分别与脂质体／多肽和Y26732共同培养,观察各组测量60个轴突长度均数:A组(DRGNs+PBS)为391±20um,B组(DRGNs+完全性截瘫大鼠脊髓提取液)为107±21um,C组(DRGNs+完全性截瘫大鼠脊髓提取液+脂质体)为121±23um,D组(DRGNs+完全性截瘫大鼠脊髓提取液+Y26732)为307±16um,E组(DRGNs+完全性截瘫大鼠脊髓提取液+脂质体+抑制性小分子多肽)为367±19um,经方差分析,各组差异具有显著性统计学意义(P<0.0001),两两比较,B、C组与A、D、E组之间P<0.05,均有明显统计学意义；B、C两组之间P>0.05,无统计学意义。D、E组之间P<0.05,有统计学意义。轴突远端平均荧光密度分别是:A组为183.4±3.7 AFU／um,B组为56.1±4.2AFU／um,C组为62.7±5.9AFU／um,D组为278.1±6.2AFU／um,E组为313.4±3.6 AFU／um。经方差分析,各组差异具有显著性统计学意义(P<0.0001),两两比较,A、D、E组与B、C组差别均有显著统计学意义(P<0.0001),而B、C组之间无明显统计学差异(P>0.05),E组与A、D组差别有统计学意义(P<0.05)。其荧光密度高,TubulinβⅢ阳性表达强与其他各组。
结论:(1)脂质体介导的Rho—ROCKⅡ特异抑制性多肽转染大鼠背根节神经(DRGNs)可促进轴突生长,形成多个轴突或明显轴突分支,使用8ug抑制性多肽20μl脂质体浓度时轴突再生作用更明显。(2)适当浓度的Rho—ROCKⅡ特异抑制性多肽／脂质体转染新生大鼠背根节神经元DRGNs和Y27632均可促进轴突延长,脂质体介导的抑制性多肽转染DRGNs比Y27632干预作用更明显。