研究背景广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonesis,AC)是1935年由我国学者陈心陶教授在广州家鼠肺部发现并命名,是非适宜宿主(人、小鼠)嗜酸粒细胞增多性脑膜炎或脑膜脑炎(eosinophilic meningitis or meningoencephalitis)的重要病原体。哺乳动物感染通常是由于食用了生的或半生的含有三期感染期幼虫的螺类、淡水虾蟹或被幼虫污染的蔬菜。感染广州管圆线虫后,病人可有严重的嗜酸粒细胞增多性脑膜炎或脑膜脑炎,有时可能会出现眼部视神经炎。在过去十几年中,广州管圆线虫病遍及东南亚,太平洋岛屿,一些南美国家和一些爆发疫情的地区,特别是在中国大陆。广州管圆线虫的终宿主为鼠类,我国大陆广州管圆线虫的终宿主主要为褐家鼠。它的中间宿主主要是软体动物,主要为蜗牛和蛞蝓。淡水虾和青蛙作为其转续宿主。据报道,广州管圆线虫三期幼虫即感染期幼虫(L3)感染人和小鼠会引起中枢神经系统(CNS)的严重损害。由于老鼠和蜗牛在世界上很多地方分布,将增加广州管圆线虫病传播的可能性。广州管圆线虫病一直被认为是一个公共健康问题,并引起广泛的关注。广州管圆线虫脑内幼虫在适宜宿主和非适宜宿主体内的发育是有差异的。在适宜宿主和非适宜宿主体内,大部分三期幼虫均移行到中枢神经系统。在适宜宿主(如大鼠)的脑内,三期幼虫分别经过一次和两次蜕皮变成四期和五期幼虫,然后移行到肺动脉发育为成虫。在非适宜宿主(如小鼠、人)体内,三期幼虫不能完成它们的生活史,而是在中枢神经系统滞留直至死亡,在这过程中将会引起嗜酸性粒细胞脑膜炎。目前大鼠脑内幼虫和小鼠脑内幼虫表达的差异蛋白是否是引起适宜宿主和非适宜宿主脑内幼虫的发育程度和致病性不同的原因尚有待研究。因此,本研究致力于分析和鉴定适宜宿主和非适宜宿主脑内幼虫表达的差异蛋白。差异蛋白质组学常用于筛选、鉴定不同发育阶段寄生虫表达的蛋白质的差异和变化,为药物治疗和抗感染疫苗的研制提供新的靶标。在广州管圆线虫的研究方面,应用差异蛋白质组学的文献如下:①用于研究广州管圆线虫雌雄成虫体内表达的蛋白;②研究了不同发育阶段广州管圆线虫的37种蛋白;③广州管圆线虫三期和五期幼虫蛋白质表达谱的比较发现三期幼虫体内的细胞骨架蛋白和膜蛋白含量比五期幼虫表达量高。迄今,未见差异蛋白质组学用于不同宿主脑内广州管圆线虫幼虫差异表达蛋白的报道。另外,在我们以前的研究中,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果发现大鼠和小鼠脑内幼虫的蛋白质条带有差异。本研究中,我们采用了双向凝胶电泳(2D-DIGE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)来分析大鼠脑内广州管圆线虫幼虫(the intracranial A.cantonensis larvae in rats,ILR)和小鼠脑内广州管圆线虫幼虫(the intracranial A cantonensis larvae in mice,ILM)的差异表达的蛋白质。结果表明,差异表达的蛋白质(dim-1和act-1)可能与广州管圆线虫在不同宿主脑内的发育和致病性相关。本研究拟阐明适宜宿主和非适宜宿主脑内幼虫的发育和致病性的差异是否与这些差异蛋白质的功能有关。目的1.筛选大鼠和小鼠脑内广州管圆线虫幼虫的差异表达蛋白;2.分析探讨差异表达蛋白在广州管圆线虫中的发育与致病中的潜在功能。方法1.广州管圆线虫感染宿主模型建立观察及脑内幼虫相关结构观察使用人工消化液,37℃消化被广州管圆线虫三期幼虫(L3)感染的白玉蜗牛,2.5小时后,80目筛网过滤去除白玉蜗牛组织碎屑,用PBS洗涤3次,2500rpm/min,5min,离心收集幼虫,解剖镜下挑虫。以50条广州管圆线虫感染期幼虫分别感染大鼠和小鼠,成功建立广州管圆线虫感染大鼠和小鼠动物模型。以50条广州管圆线虫感染期幼虫分别感染大鼠和小鼠,成功建立广州管圆线虫感染动物模型。大鼠感染模型使用SD大鼠,小鼠使用BALB/c小鼠,到21天后解剖两种宿主并采集大鼠和小鼠脑内幼虫,光镜观察大鼠和小鼠脑内幼虫体长、体宽并分析其差异。2.蛋白质提取分别从大鼠和小鼠脑内分离出广州管圆线虫的幼虫,将幼虫与500μl裂解缓冲液充分混合,在冰上超声处理,然后离心,4℃,收集上清。将上清液转移到一个干净的管中,并与4倍体积的丙酮混合。蛋白质浓度通过使用根据制造商的说明在2D定量试剂盒BCA方法测定。3.等电聚焦电泳(Isoelectronic Focusing)蛋白最初使用的Ettan IPGphor等电聚焦系统(GE Healthcare),并集中到其等电点是24厘米的固体干胶条(GE Healthcare)上,被分离。在等电点聚焦后,将固相pH梯度(IPG)条中平衡在缓冲液15分钟,接着第二次洗涤15分钟,加入含碘乙酰胺的平衡缓冲液。如不及时进行SDS—PAGE电泳,胶条可-80℃暂存。4.SDS—PAGE凝胶和凝胶硝酸银染色用于2D-DE的SDS-PAGE中,IPG胶条分别发生在12.5%聚丙烯酰胺凝胶,并用1%(重量/体积)琼脂糖密封。电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并切角以作记号,分析型银染采用质谱兼容的硝酸银染色。5.凝胶图像分析利用UMAX PowerLook 1100透射扫描仪获取图像,用PDQuest 7.1.0软件包进行图像分析,分析包括蛋白质斑点的检测、量化、背景去除和点的匹配。蛋白质斑点自动检测后,每个蛋白质斑点得到指定的SSP号码,再进行点的编辑去除一些杂点,蛋白质斑点匹配前从小鼠样品凝胶中选取一块作为参考胶(Reference gle),并建立一些匹配点(Landmark),然后自动匹配其它蛋白质斑点,与参考胶中不匹配的点自动加到参考胶中。对比分析2组凝胶,选取表达量差异2倍以上的点作为后续质谱分析的候选蛋白质点。6.胶内酶切胶内酶切时,加入10μL测序级胰蛋白酶(购自美国Sigma公司),37℃过夜消化。酶解产物用50μL含5%TFA/50%ACN的溶液萃取2次。合并萃取液,经冷冻干燥仪浓缩至4～5μL。7.MALDI-TOF质谱分析酶切结束后,含多肽混合物的样品与α-氰基-4-羟基肉桂酸的溶液混合点样于质谱分析板上,空气中自然干燥后用Voyager-DE STR质谱仪(美国Applied Biosystems公司)进行分析。所得到的数据用Mascot数据库(http://www.matrixscience.com/)解析,搜索条件如下:物种:线虫,胰酶酶切(允许1个漏切位点),半胱氨酸碘乙酰化,质量误差:100 ppm。8.Real-time PCR分析检测蛋白表达水平用 Trizolreagent(Invitrogen,USA)提取脑内幼虫总 RNA。用 NanoDrop2003(Thermo Scientific,USA)测 RNA 的浓度和 OD 值(A260/A280)。脑内幼虫 RNA采用Thermo scientific第一链cDNA合成试剂进行逆转录,用SYBRTM Select Master Mix试剂盒检测dim-1、act-1和18S rRNA ITS-1的表达水平,其中18S rRNAITS-1作为内参。9.生物信息学分析用 UniprotKB/SwissProt 数据库、Mascot 数据库(http://www.matrixscience.com)和 NCBI 数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行肽段比对。并将比对到的蛋白点进行GO分析。10.统计学分析所有的数据是:平均数±标准差(mean ± standard deviation(SD))。采用Student’s T检验进行两样本之间的显著性分析,检验水准为:p<0.05,数据显著性分析采用SPSS13.0。结果1.广州管圆线虫感染宿主模型建立以及幼虫相关结构观察1.1感染后宿主观察广州管圆线虫感染大鼠和小鼠模型观察发现:小鼠模型约自12dpi开始逐渐出现毛发脱落、脊柱后凸和打转等体征,症状一直持续。大约15dpi时,小鼠上述症状明显加重并开始出现死亡。大鼠模型发现只出现脱毛症状。1.2幼虫光镜观察21dpi解剖采集大鼠和小鼠脑内的幼虫,将幼虫体长、体宽并进行统计学分析认为:两种宿主脑内幼虫的长度、宽度差异具有统计学意义(P<0.01),大鼠脑内幼虫发育程度较小鼠脑内幼虫发育程度高。2.二维电泳的蛋白质组学结果这些蛋白质点的等电点在4-7之间,分子量在10-170kDa之间。在这29种差异表达的蛋白质中,17种在小鼠脑内幼虫体内表达含量更高,其中12种比大鼠脑内幼虫的表达含量高10倍以上。剩下的12种蛋白质在大鼠脑内幼虫体内表达含量更高,其中6种比小鼠脑内幼虫的表达含量高达10倍以上。然后用Mascot和NCBI数据库查询有相同等电点和分子量的蛋白质。3.差异表达蛋白质的鉴定识别这29种蛋白质点被切割下来,然后作基质辅助激光解吸电离质谱法分析。从质谱仪上获得的肽段通过Mascot数据库识别,其中22种蛋白质被成功确定(大于95%的可信区间内),另外7种在数据库内没有比对到。将比对到的蛋白点进行基因本体论(Gene ontology,GO)分析,发现这22种蛋白质参与ATP分解代谢和合成代谢过程,多细胞生物生长发育的正调控过程,吞咽过程和生殖过程等等。这些差异表达的蛋白质主要分布于细胞膜和细胞质。从质谱分析获得的肽段和秀丽隐杆线虫蛋白质数据库相比较,鉴定的蛋白质为dim-1,act-1和act-2,它们都参与ATP分解代谢和合成代谢过程。Act-1和act-2在小鼠脑内幼虫体内表达更高,而dim-1则在大鼠脑内幼虫体内表达更高。4.差异表达蛋白荧光实时定量PCR用广州管圆线虫的18SrRNA的第一内部转录间隔区(18SrRNA ITS-1)作为内参做荧光实时定量PCR(qPCR)分析大鼠和小鼠脑内幼虫act-1和dim-1的表达量。结果发现act-1在BALB/c小鼠脑内表达更高(p<0.05),dim-1在SD大鼠脑内表达更高(p<0.01)。这些结果和二维电泳得到的结果相一致,说明这些差异表达蛋白在转录水平上参与调控。结论1.发现大鼠和小鼠脑内广州管圆线虫幼虫出现29个差异表达蛋白质点,这些蛋白质点的等电点在4到7之间,分子量在10到170kDa之间。其中,17种在小鼠脑内幼虫体内表达高于大鼠脑内幼虫。2.qPCR验证结果显示act-1和dim-1(蛋白质点29和蛋白质点9)和二维电泳分析结果相一致,根据其他线虫研究结果,推测dim-1、act-1可能在广州管圆线虫的发育和致病机制及其与宿主的相互关系中发挥重要作用。