【研究背景与目的】慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD）是一种以进行性、不完全可逆性气流受限和肺部炎性病变为主要特征的慢性肺部疾病,具有反复发作、进行性发展的特点,是呼吸系统的常见病和多发病,发病率和死亡率居高不下,并且呈逐年上升趋势^[1-2]。吸烟、空气污染、呼吸道感染等因素可诱发COPD急性发作或加重,即我们通常所说的慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）。AECOPD是COPD的急性起病过程,其特征是患者呼吸系统症状恶化,超出日常变异,需要改变药物治疗等。此期患者的主要症状是气促加重,常伴有喘息、胸闷、咳嗽加剧、痰量增加、痰液颜色和黏度改变以及发热等。据世界卫生组织预计,到2020年,以COPD为主的肺部疾病死亡率将上升到第三位,成为世界疾病经济负担的第五位^[3]。流行病学研究结果表明,全球40岁以上成年人的COPD发病率为10%左右^[4],我国目前COPD患者约有1亿,约占全世界COPD患者人数的25%。研究结果还显示,我国20岁及以上成人的COPD患病率为8.6%,40岁以上则高达13.7%,60岁以上超过27%,男性患病率是女性的2.2倍^[5]。老年COPD患者还经常出现呼吸衰竭、肺心病、肺癌等严重并发症^[6],严重影响患者的生活质量,同时给社会带来沉重的经济负担,COPD已成为一个亟待解决的公共卫生问题。西医对AECOPD的治疗包括避免发病的高危因素、药物治疗、外科治疗、其他疗法等^[7]。药物治疗主要有支气管舒张药、祛痰药、糖皮质激素、抗生素等。β₂肾上腺素受体激动剂、抗胆碱能药、茶碱类等支气管舒张剂在一定程度上可改善COPD患者的临床症状,减轻患者痛苦。糖皮质激素和抗生素的及时使用也对部分患者病情进展起到了一定控制作用,但并非对所有患者都有效。且无法改变患者肺功能进行性下降的事实,后续仍有反复发作并呈进行性发展。目前尚未发现有效的根治COPD的药物。中医药对COPD的治疗,包括內治法和外治法两种。內治法根于久病肺虚,日久累计脾、肾、心的机制,治疗时充分发挥辨证论治的特色,抓住治标、治本两个方面,祛邪与扶正共施,依其标本缓急,有所侧重。临床疗效显著,很大程度上改善了COPD患者的症状,提高了患者的生活质量^[8]。外治法中的针灸^[9]、拔罐^[10]、穴位贴敷^[11]等也显示出对COPD的良好疗效。中医药治疗COPD具有一定的优势,也取得了一定的成绩。但由于目前中医尚无统一的疗效评定标准,加上中药复方成分复杂,作用机制尚不十分明确。在这种情况下,寻找治疗COPD的新药物、新方法成为必要。五味子是木兰科植物五味子的干燥成熟果实,具有收敛固涩,益气生津,补肾宁心之功效;可用于久咳虚喘;梦遗滑精,遗尿尿频;久泻不止;自汗,盗汗;津伤口渴,内热消渴;心悸失眠等症。中药五味子用于慢性阻塞性肺疾病、支气管炎、支气管扩张、虚咳久嗽等呼吸系统疾病的治疗由来已久,且取得了很好的临床疗效。本课题组前期应用全真一气汤治疗COPD,取得了较好的临床效果^[12-13]。但其在治疗COPD过程中药效物质基础及作用机制尚不十分明确。近年来,对五味子化学成分的开发和药理作用的研究表明,五味子的主要成分有木脂素类、多糖类、三萜类、挥发油类、有机酸、脂肪油、氨基酸、色素、靴质等,其中木脂素类是五味子的主要有效成分^[14-15],包括五味子素和它的类似物α、β、γ、δ、ε五味子素、伪γ五味子素、五味子甲素、五味子乙素、新五味子素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙等。而五味子甲素和五味子乙素是五味子木脂素类主要活性成分之一,是目前已明确的五味子中含量较大的单体成分^[16-17]。我们推测五味子活性成分甲素和乙素对AECOPD具有一定的治疗作用。本课题研究目的就是采用香烟烟雾提取物和脂多糖制备AECOPD体外模型,探讨五味子甲素和五味子乙素在AECOPD治疗中的作用及其发挥作用的机制,以期为五味子甲素和五味子乙素应用于COPD急性加重期的临床治疗提供实验依据。【研究内容与方法】1.五味子甲素对香烟烟雾提取物和脂多糖诱导的肺上皮细胞干预作用研究（1）AECOPD体外模型的制备:用4%CSE联合0.1μg/ml LPS直接作用于肺上皮细胞A549 24h,制备AECOPD体外细胞模型。（2）MTT法检测Sch A对肺上皮细胞生长的影响:体外培养肺上皮细胞A549 24h,将1-60μM按照比例分为不同浓度的Sch A直接作用于肺上皮细胞,通过MTT法进一步确定药物的使用浓度。然后用MTT法检测Sch A对CSE联合LPS诱导的肺上皮细胞存活率的影响。（3）比色法检测Sch A对肺上皮细胞抗氧化指标含量的影响:收集细胞培养液上清,比色法检测细胞上清中MDA、SOD、GSH等抗氧化指标含量的变化。（4）RT-PCR法检测Sch A对肺上皮细胞相关细胞因子mRNA水平的影响:提取细胞总RNA,RT-PCR法测定Sch A对肺上皮细胞细胞因子IL-8、HO-1的mRNA水平的变化。（5）ELISA法检测Sch A对肺上皮细胞相关细胞因子含量的影响:收集细胞培养液上清,ELISA法测定Sch A对肺上皮细胞细胞因子IL-8、HO-1的含量的影响。（6）Western Blot法检测Sch A对肺上皮细胞相关蛋白表达的影响:裂解细胞收集细胞总蛋白,用Western Blot方法检测Sch A对肺上皮细胞磷酸化NF-κB蛋白水平的变化。2.五味子乙素对香烟烟雾提取物和脂多糖诱导的肺上皮细胞干预作用研究（1）AECOPD体外模型的制备:用4%CSE联合0.1μg/ml LPS直接作用于肺上皮细胞A549 24h,制备AECOPD体外细胞模型。（2）MTT法检测Sch B对肺上皮细胞生长的影响:体外培养肺上皮细胞A549 24h,将1-60μM按照比例分为不同浓度的Sch B直接作用于肺上皮细胞,通过MTT法进一步确定药物的使用浓度。然后用MTT法检测Sch B对CSE联合LPS诱导的肺上皮细胞存活率的影响。（3）RT-PCR法检测Sch B对肺上皮细胞相关细胞因子mRNA水平的影响:提取细胞总RNA,RT-PCR法测定Sch B对肺上皮细胞细胞因子IL-8、COX-2的mRNA水平的影响。（4）ELISA法检测Sch B对肺上皮细胞相关细胞因子含量的影响:收集细胞培养液上清,ELISA法测定Sch B对肺上皮细胞细胞因子IL-8、COX-2的含量的影响。（5）Western Blot法检测Sch B对肺上皮细胞相关蛋白表达的影响:裂解细胞收集细胞总蛋白,用Western Blot方法检测Sch B对肺上皮细胞磷酸化NF-κB蛋白水平的变化。【研究结果】1.五味子甲素对香烟烟雾提取物和脂多糖诱导的肺上皮细胞干预作用研究（1）Sch A对肺上皮细胞A549存活率的影响:MTT法检测细胞存活率,结果显示,不同浓度的Sch A均对肺上皮细胞A549的过度增殖有一定的抑制作用（P<0.05）,且浓度越高,抑制作用越大;与对照组相比,模型组细胞存活率升高（P<0.05）,与模型组相比,不同剂量Sch A组细胞存活率下降（P<0.01）。（2）Sch A对肺上皮细胞A549 MDA、SOD、GSH抗氧化指标含量的影响:比色法检测MDA、SOD、GSH抗氧化指标,结果显示,与对照组相比,模型组MDA含量增加（P<0.01）,SOD、GSH含量减少（P<0.05）,与模型组相比,MDA含量减少（P<0.05）,SOD、GSH含量增加（P<0.05）。（3）Sch A对肺上皮细胞A549细胞因子IL-8、HO-1 mRNA表达水平及培养上清中IL-8、HO-1含量的影响:RT-PCR法检测细胞因子,结果显示,与对照组相比,模型组细胞因子IL-8、HO-1水平上调（P<0.05）,与模型组比较,不同剂量Sch A组细胞因子IL-8下调（P<0.05）,HO-1水平上调（P<0.05）。ELISA法测定细胞因子,结果与RT-PCR结果一致。（4）Sch A对肺上皮细胞A549细胞磷酸化NF-κB蛋白水平的影响:Western Blot方法检测蛋白水平,结果显示,与对照组相比,模型组细胞磷酸化NF-κB蛋白水平上调（P<0.05）,与模型组比较,不同剂量Sch A组细胞磷酸化NF-κB蛋白水平下调（P<0.05）。2.五味子乙素对香烟烟雾提取物和脂多糖诱导的肺上皮细胞干预作用研究（1）Sch B对肺上皮细胞A549存活率的影响:MTT法检测细胞存活率,结果显示,不同浓度的Sch B均对肺上皮细胞A549过度增殖有一定的抑制作用（P<0.05）,浓度越高,抑制作用越大;与对照组相比,模型组细胞存活率较高（P<0.05）,与模型组相比,不同剂量Sch B组细胞存活率下降（P<0.01）。（2）Sch B对肺上皮细胞A549 IL-8、COX-2 mRNA表达水平及培养上清中IL-8、COX-2含量的影响:RT-PCR法检测细胞炎症因子,结果显示,与对照组相比,模型组细胞因子IL-8、COX-2水平上调（P<0.05）,与模型组比较,不同剂量Sch B组细胞因子IL-8、COX-2水平均下调（P<0.05）。ELISA法测定细胞炎症因子,结果与RT-PCR结果一致。（3）Sch B对肺上皮细胞A549细胞磷酸化NF-κB蛋白水平的影响:Western Blot方法检测蛋白水平,结果显示,与对照组相比,模型组细胞磷酸化NF-κB蛋白水平上调（P<0.05）,与模型组比较,不同剂量Sch B组细胞磷酸化NF-κB蛋白水平下调（P<0.05）。【研究结论】1.Sch A能抑制香烟烟雾提取物和脂多糖诱导的肺上皮细胞相关氧化指标含量的表达,具有一定的抗氧化应激作用。2.Sch B能抑制香烟烟雾提取物和脂多糖诱导的肺上皮细胞相关炎性因子的表达,具有一定的抗炎作用。3.Sch A和Sch B是五味子的重要活性成分,是五味子发挥抗炎作用和抗氧化应激作用的药效物质基础。