随着我国经济社会的发展,以糖尿病和恶性肿瘤为代表的慢性、非传染性疾病已严重威胁着人们的健康。2型糖尿病(T2DM)是复杂的多基因遗传病,流行病学调查显示,T2DM可增加某些癌症的的患病率,最常见的是消化系统肿瘤,其中结肠癌位居首位。既往主要通过全基因组关联研究(GWAS)确定与T2DM风险相关的基因,这其中就包括ADP-核糖基化样因子(ARL15)基因。ARL15属于ADP-核糖化因子(ARF)家族中的成员,ARF家族的功能是参与囊泡运输和肌动蛋白的重组,ARL与ARF成员之间有40%～60%的序列同源性。ARL15既调节膜转运、脂质组成和胰岛素信号转导途径,又参与炎症反应,而T2DM与肿瘤的相互作用机制包括高胰岛素、高胰岛素样生长因子1(IGF-1)、高血糖、肥胖以及慢性炎症等。因此ARL15很可能参与T2DM的发病以及结肠癌的发生。本研究利用群体遗传学方法探讨ARL15基因多态性及ARL15水平与脂联素、胰岛素、生理生化指标的相关性以及T2DM发病风险,但是多基因遗传病具有微效基因累加效应特征,因此将另一个T2DM易感基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α基因(PGC-1α)与ARL15相互作用观察以上指标的关联性;设想利用细胞学、免疫组化及分子生物学等技术研究ARL15是否通过肿瘤细胞中糖代谢、脂肪代谢参与结肠癌的发生,探讨ARL15的生物学功能,本研究将通过以下两个部分进行研究。第一部分ARL15、PGC-1α基因多态性联合作用与T2DM的关联分析目的:探讨ARL15与PGC-1α基因单核苷酸多态性(SNPs)rs255758、rs7656250累加效应与T2DM的相关性,以及ARL15基因SNP与ARL]5水平及脂联素(PA)、胰岛素(INS)、血脂、体重指数(BMI)等指标与T2DM的相关性。方法:采用病例对照设计,收集葡萄糖耐量正常对照组(NGT)102例,T2DM患者256例。采用LDR以及SnaPshot Multiplex进行SNP分型及测序;采用ELISA检测血清ARL15、INS、PA水平;采集生理生化指标计算体重指数(BMI)和腰臀比(WHR)。运用Hardy-Weinberg平衡定律,确定研究样本的群体平衡。应用SHEsis在线软件进行等位基因及基因型的频率分布,采用SPSS 25.0对数据进行统计学分析,应用两个独立样本秩和检验对各组临床指标的检测结果进行统计分析,用M(P25,P75)表示。利用Spearman相关法分析ARL15水平与其他因素的相关性。采用二元回归分析,分析T2DM的危险因素。结果:1.rs255758、rs7656250位点在NGT组,T2DM组和高BMI组中等位基因频率、基因型频率均已达到遗传平衡(p>0.05),具有群体代表性。2.rs255758位点等位基因频率、基因型频率在NGT组,T2DM组,高BMI组任意两组的比较中,均不存在统计学差异,p>0.05。rs7656250位点等位基因C频率在高BMI组显著高于NGT组,差异有统计学意义,p<0.05,高BMI组携带TC基因型频率显著高于NGT组,差异有统计学意义,p<0.05,结果还显示携带TC基因型的T2DM组频率显著高于NGT组,差异有统计学意义,p<0.05。3.当AA-TT基因型联合作用时,高BMI组与NGT组存在显著差异,p<0.05，OR=0.526,95%CI=0.306-0.902;AA-TC基因型联合作用时,高BMI组与NGT组也存在显著差异,p<0.05,OR=1.865,95%CI=1.018-3.216。4.rs255758位点不同基因型在NGT组内WHR水平存在显著差异,p<0.05,具有统计学意义,且携带CC基因型个体的WHR水平低于AC和AA基因型的WHR水平。在T2DM组中PA水平存在显著差异,p<0.05,且携带CC基因型个体的PA水平小于AC基因型的PA水平。rs7656250位点不同基因型在NGT、T2DM及高BMI组内与全部检测指标进行关联分析均不存在显著差异,p>0.05。5.FPG、ARL15水平与T2DM呈正相关,是T2DM的危险性因素。6.高BMI组中ARL15 水平与TC、PA、INS具有相关性。ARL15 水平与TC、INS呈正相关,r值为0.154和0.190。ARL15水平与PA呈负相关,r值为-0.426。小结:1.ARL15基因rs255758位点等位基因频率、基因型频率分布与T2DM组及高BMI组之间不存在相关性,PGC-α基因rs7656250位点C等位基因可增加BMI的风险1.485倍,PGC-1α基因rs7656250位点C因子可能是增加T2DM罹患高BMI的危险因子。2.携带AA-TC基因型的人群,会增加高BMI的风险约1.9倍,携带AA-TT基因型时,会降低高BMI的风险,提示当ARL15基因rs255758位点与PGC-α基因rs7656250位点AA-TC联合基因型后,可能增加罹患T2DM及BMI的风险。3.ARL15是T2DM的危险因素,与TC、PA、INS均具有相关性。第二部分ARL15在结肠癌细胞糖、脂代谢中作用机制的研究目的:探讨ARL15通过糖、脂代谢与结肠癌发生的机制。方法:利用有丝分裂阻滞剂Nocodazole诱导HUVEC细胞阻滞在有丝分裂期和间期,采用免疫组化及细胞免疫荧光确定ARL15在组织及细胞中的表达位置。分别构建ARL15质粒、siRNA,转染后利用免疫印迹技术检测ARL15在过表达、低表达时结肠癌细胞内与糖、脂代谢相关蛋白的表达情况,利用qRT-PCR法检测结肠癌细胞内与糖、脂代谢相关基因mRNA转录水平;JIB-04作用于结肠癌细胞后,利用免疫印迹技术检测ARL15及结肠癌细胞内与糖、脂代谢相关蛋白的表达情况,利用qRT-PCR法检测ARL15及结肠癌细胞内与糖、脂代谢相关基因mRNA转录水平。结果:1.ARL15在HUVEC细胞有丝分裂期的表达比间期高,差异具有统计学差异,p<0.05。2.免疫组化可见结肠癌组织中ARL15高表达,呈深褐色,而正常结肠组织ARL15也有表达,基底层呈淡褐色,并且均表达在胞浆中。3.ARL15在FHC细胞、HCT116、SW620细胞中均有表达。ARL15在细胞表达的位置一致,主要分布在胞浆中。4.在HCT116中转染pCMV-3Tag-2-ARL15质粒,培养36h后,提取对照组和实验组的蛋白,利用免疫印迹技术检测发现,ARL15过表达后,FSAN、AKT、P-AKT、P-GSK、SREBP-1(p125)、AMPK蛋白的表达高于正常对照组,差异具有统计学意义,p<0.05。qRT-PCR技术检测发现,ARL15过表达后,上调FASN、GSK、AMPα1、SREBP-1基因mRNA转录水平,与control相比,差异具有统计学意义,p<0.05。5.在HCT116中转染siRNA,培养36h后,提取对照组和实验组的蛋白,利用免疫印迹技术检测发现,ARL15 低表达后,PKM2、PFK、FSAN、AKT、P-AKT、P-GSK、AMPK 蛋白的表达含量下降,差异具有统计学意义,p<0.05。qRT-PCR技术检测发现,ARL15低表达后,下调FASN、GSK、AMPKα1基因mRNA转录水平,与control相比,差异具有统计学意义,p<0.05。6.加入2μM的JIB-04后,三种不同的结肠癌细胞中ARL15蛋白的表达量均下降,随着时间的变化,ARL15蛋白表达在不同结肠癌细胞株中趋势不相同。7.加入 2 μ M 的 JIB-04 后,培养 24h 后 HCT116、HT29 和 SW620 细胞中 AKT、P-GSK、FASN、AMPK、SREBP-1蛋白的表达量明显下降,差异具有统计学意义,p<0.05。8.qRT-PCR 技术检测 AKT、P-GSK、FASN、AMPK、SREBP-1 基因的 mRNA水平在加药组中的表达量明显低于正常对照组,差异具有统计学意义,p<0.05。小结:1.ARL15蛋白在有丝分裂期的表达高于间期,ARL15可能参与细胞增殖。2.ARL15在过表达和低表达时发现与糖、脂代谢相关蛋白呈正相关,ARL15可能参与结肠癌细胞糖、脂代谢途径。3ARL15蛋白在结肠癌组织中的表达高于正常结肠组织,ARL15很可能通过增加AKT和AMPK下游代谢通路糖原、脂肪的合成,促进结肠癌的发生,靶向作用于ARL15可能对治疗结肠癌会有一定的作用。4.JIB-04作用于结肠癌细胞后,ARL15表达明显降低,并且影响AKT和AMPK下游信号通路糖、脂代谢相关蛋白的表达。结论1.ARL15基因rs255758位点和PGC-1α基因rs7656250位点相互作用后,AA-TC联合基因型可增加罹患T2DM及高BMI的风险约1.9倍。2.ARL15是T2DM的危险因素,与TC、PA、INS均具有相关性,ARL15通过增加AKT和AMPK下游代谢通路糖原、脂肪的合成,促进结肠癌的发生,JIB-04作用于结肠癌细胞后,降低ARL15蛋白的表达量,并且影响AKT和AMPK下游信号通路糖、脂代谢相关蛋白的表达。