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目的类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种由多种原因引起的退行性关节疾病,但具体的发病机制尚不清楚。本课题组前期实验证实,酸敏感离子通道1a(acid-sensing ion channel 1a,ASIC1a)被胞外酸通过介导胞外Ca2+内流活化,且ASIC1a介导的关节软骨细胞凋亡在RA进展过程中发挥重要的作用。本研究主要目的是在体外探究自噬对ASIC1a介导的大鼠关节软骨细胞凋亡的影响,探讨自噬在RA发病进程中的作用。方法体外分离、提取及培养原代大鼠关节软骨细胞,给于适宜浓度的浓盐酸刺激,体外建立早期RA模型。在此基础上,采用ASIC1a特异性阻断剂狼蛛毒素(psalmotoxin 1,Pc TX1)及ASIC1a短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)阻断或沉默ASIC1a,实验分为正常组、p H6.0组、Pc TX1组、p H6.0+Pc TX1组和正常组、p H6.0组、ASIC1a sh RNA组、p H6.0+ASIC1a sh RNA组,分别观察ASIC1a对自噬和凋亡的影响。采用自噬特异性阻断剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)及Beclin1小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)阻断或沉默自噬,实验分为正常组、p H6.0组、,3-MA组、p H6.0+3-MA组和正常组、p H6.0组、Beclin1 si RNA组、p H6.0+Beclin1 si RNA组,观察自噬对ASIC1a介导的酸诱导的大鼠关节软骨细胞凋亡的影响。透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)观察细胞内自噬小体;单丹黄酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)染色观察自噬囊泡的形成;GFP-m RFP-LC3观察自噬成熟过程;Western blot技术分析自噬相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达情况;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果胞外酸化可明显上调自噬蛋白LC3-II水平,显著增加胞质内自噬小体数量;胞外酸化(p H6.0)3h自噬蛋白LC3-II、Beclin1,凋亡相关蛋白剪切性PARP、剪切性Caspase-3及剪切性Caspase-9均高表达,该过程可被Pc TX1及ASIC1a sh RNA逆转;3-MA降低ASIC1a介导的细胞自噬,并增加ASIC1a介导的细胞凋亡,表现为LC3-II、Beclin1蛋白的下调,剪切性PARP、剪切性Caspase-3及剪切性Caspase-9蛋白的上调以及细胞凋亡率的增加;此外,预处理的Beclin1 si RNA降低了自噬蛋白LC3-II、Beclin1的表达,增加了凋亡蛋白剪切性PARP、剪切性Caspase-3及剪切性Caspase-9的表达以及上调了细胞凋亡率。结论结果显示激活的ASIC1a可在体外介导大鼠关节软骨细胞凋亡和自噬的发生,阻断或沉默自噬可以增强ASIC1a介导的细胞凋亡,因此在RA发病过程中自噬可能被作为一种新的机制参与了ASIC1a介导的关节软骨细胞凋亡。自噬的检测有助于进一步揭示早期关节损伤和RA的发病机制。