禾谷镰刀菌MCM1基因的功能研究

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:tianchaoguoshi
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在真核生物细胞中MADS-box基因通过与其它转录因子互作调控多种生物过程。在酵母,植物,昆虫,线虫,哺乳动物和低等的脊椎动物中都有MADS-box蛋白的存在。目前,植物的数据库中有上百种MADS-box结构域的蛋白。这些蛋白都具有保守的DNA结合和二聚体化结构域(MADS-box结构域)。目前MADS-box五个家族成员已被发现,酵母中的Mcm1和Arg80,拟南芥中的Agamous,人类中的Deficiens和SRF。赤霉基因组中含有两类MADS-box转录因子,其中之一与酵母的MCM1同源,属于SRF类的MADS-box转录因子(I型),在酵母中MCM1的敲除突变体是致死的;另外一个与酵母当中的Rl M1同源,属于MEF2类的MADS-box转录因子(II型)。Mcm1蛋白在各种生物过程中都发挥着重要的作用,包括微小染色体维持蛋白,新陈代谢,细胞识别和信息素应答。本研究鉴定了禾谷镰刀菌中MADS-box蛋白Fg Mcm1的功能。Fgmcm1突变体的分生孢子产量与野生型相比大约降低了2000倍,突变体不能够产生产孢结构?瓶梗,孢子直接在菌丝顶端产生。Fgmcm1突变体在分生孢子的形态上也有缺陷,77.2±5.6%的分生孢子有1-3个细胞。19.9±1.7%的分生孢子顶端有一个细胞是断裂的,通过(DAPI/Calcoflour)染色发现断裂的分生孢子与顶端是相连的。野生型的分生孢子每个细胞含有单个细胞核,而突变体的分生孢子每个细胞里有多个细胞核。这些观察结果表明Fg MCM1调控瓶梗和分生孢子的发育。有性阶段,Fgmcm1敲除突变体不产子囊壳,这说明Fg MCM1在调节有性生殖过程中发挥着重要的作用。Fgmcm1突变体对氧化还原和膜胁迫都降低了敏感性。通过扬花盛期的小麦穗、玉米秆侵染实验证明,Fgmcm1突变体无论在致病性和DON的产量上都严重降低。通过随机插入带有MCM1自身启动子的MCM1-GFP融合片段到Fgmcm1突变体中,获得MCM1基因互补转化子。互补转化子分生孢子形态、产量,DON产量和致病性等方面都恢复到野生型状态。亚细胞定位实验表明,Fg MCM1-GFP信号无论在孢子还是菌丝中都定位在细胞核。大约50%的Fgmcm1突变体的菌落形态是不稳定的,能够产生菌落形态特别小的菌株MD(例如MD1,MD2),在各种固体培养基中,包括CM,MM和5×YEG都存在类似现象。MD的菌丝宽度是不规则,菌落能够长出类似于扇形的角变菌落,将这些突出的扇形角变菌落重新接种,其生长速度能够恢复到Fgmcm1突变体的状态。在异宗配合的轮枝镰孢菌敲除Fvmcm1突变体,并没有发现菌落形态不稳定的现象。与野生型比较,类似于Fgmcm1突变体,Fvmcm1突变体的产孢率(包括大孢子和小孢子),真菌毒素FB1的产量,均出现显著下降。Fvmcm1突变体的瓶梗也是缺陷的,要比野生型细而长。在萌发条件下,小孢子能够直接萌发产生小孢子,这可能是由于Fv MCM1的敲除导致细胞之间的识别缺陷所引起的。酵母双杂交实验表明Fg Mcm1既与Mat1-1-1互作也和Fst12互作,而这两个转录因子对有性生殖都是至关重要的。Fgmcm1 mat1-1-1双突变体的菌落形态是稳定的,生长速度与Fgmcm1突变体相同,而Fgmcm1 fst12双突变体的菌落形态是不稳定的,大约有42.6﹪的Fgmcm1 fst12双突变体能够产生菌落形态生长发育不良的表型。这就说明Fgmcm1突变体菌落形态不稳定的现象可能是由于Fg MCM1的敲除导致与配体位点的基因互作发生变化而引起的。RNA-seq分析表明,相对于突变体Fgmcm1菌株,在生长缺陷菌株MD1中,一定数量的与有性生殖相关的基因在MD1里是上调表达的,这就进一步说明为什么MD1的生长速度是受限制的。与野生型相比较,与致病性、次生代谢和产孢相关的基因在突变体Fgmcm1是下调表达的。综上所述,在禾谷镰刀菌中,Fg Mcm1在调控瓶梗、分生孢子的形成,有性生殖,致病性,次生代谢和细胞识别过程中都发挥着至关重要的作用。
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