肝纤维化是肝脏遭受各种急慢性致病原侵袭,如：慢性乙型肝炎病毒,血吸虫,酒精,药物及代谢疾病等,引起肝脏损伤及炎症反应时,机体进行代偿性免疫修复而至肝内结缔组织异常增生,肝内细胞外基质过度沉积的病理过程。轻者称为肝纤维化,重者使肝小叶结构改建,假小叶及结节,成为肝硬化。肝炎患者如不及时治疗,很有可能会发展成为肝硬化或肝癌。目前对于肝硬化及肝癌并无较好的治疗方案,当病情发展至此,患者生存率极低。近年的基础和临床研究表明,如果能给予有效的病因治疗,或能直接抑制细胞外基质的合成和/或促进其降解,则已经形成的肝纤维化甚至早期肝硬化也是可以逆转的。因而,抗肝纤维也渐渐成为肝病治疗中重要方案之一目前,研究发现具有抗肝纤维化作用的药物,如秋水仙碱,马洛替酯,丹参,黄芪,苦参碱(Matrine,M),当归,甘草等,有很多已经应用于临床,但其疗效并不是很理想,为此,很多研究者都在试图寻找理想的抗肝纤维化药物。现代药理学研究发现,M与甘草甜素(Glycyrrhizin, GL)具有广泛的药理学作用：M具有抗感染,免疫调节,抗心律失常,降压,抗肿瘤抗过敏,抗病毒和抗纤维化的作用,GL具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤、护肝解毒、调节免疫功能等药理作用。GL与M各自均有多种制剂在临床中应用于肝纤维化、乙肝等的治疗,如复方甘草酸苷片(美能),甘草酸二铵胶囊,甘草酸二铵注射液,复方甘草酸苷注射液,苦参碱注射液,鞣酸苦参碱片等。有较多文献报道GL与M联合治疗慢性乙型肝炎效果良好,在降低肝纤维化指标上也有明显优势。如：索海芬[1]的临床试验表明：与单独使用拉米夫定治疗比较,苦参碱联合甘草甜素治疗在降低ALT、AST、HA、PCIII、IV-c以及TNF-a含量方面有优势,而且治疗临床总有效率高。可见M联合GL有良好的抗肝纤维化的作用。本实验室研制的甘苦口服液,主要成分即为GL与M。药效学实验表明,甘苦口服液对硫代乙酰胺诱导的大鼠肝纤维化治疗作用优于阳性对照复方甘草酸苷片(美能)；甘苦口服液较注射液而言,患者顺应性大大提高,有利于慢性乙肝患者的长期用药。甘苦口服液应用于肝纤维化的治疗,前景广阔,值得进一步的研究与开发。文献研究发现,M及GL单体的药代动力学研究报道比较多,对于它们在大鼠体内的处置过程研究比较充分,但是并无二者合用的药代动力学研究,因而,对于二者合用的非临床前药代动力学研究也显得十分有必要。本文对甘苦口服液在大鼠体内的药代动力学进行了初步的研究。本课题主要考察灌胃给予甘苦口服液后,GL及M在大鼠体内的药代动力学特征,如吸收、分布、排泄等。本课题的主要实验有：1、测血浆中甘草次酸(glycyrrhetic acid, GA)、M的RP-HPLC含量测定方法的建立；2、M在大鼠体内的药代动力学初步研究；3、GL在大鼠体内的药代动力学初步研究；4、GL与M之间在药代动力学上的相互影响。1、血浆中GA、M的RP-HPLC含量测定方法的建立血浆中M含量测定采用的内标法,选用已酮可可碱作为内标。色谱条件为：流动相：乙腈：0.1%H3P04水(三乙胺调PH至8)=35：65,流速：1mL.mmin-1,柱温30℃,紫外检测波长220nm。生物样品预处理的方法为液液萃取法,生物样品中的内源性杂质对于M的测定无干扰。经方法学验证,血浆中M在0.125-30mg·L-1浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系,R2=0.997,最低定量限为0.1mg·L-1,M的相对回收率为97.4%-104.1%,绝对回收率为60.6%-78%,日内、日间精密度分别为1.43%-1.66%、2.11%-2.77%,以上各项均达到方法学的要求。血浆中GA含量测定采用外标法,其色谱条件为：流动相：乙腈：0.05%H3PO4水=80：20,流速：0.6mL.min-1,柱温40℃,紫外检测波长254nm,生物样品预处理方法甲醇沉淀蛋白法,虽然样品处理方法简单,但是内源性杂质也并不影响GA的出峰。方法学验证结果为：GA在0.005-1Omg·L-1浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系,R2=0.999,最低定量限为0.005mg·L-1,GA的相对回收率为98.1%-103.1%,绝对回收率为65.6%-73%,日内、日间精密度分别为1.49%-1.62%、2.21%-2.89%,以上各项均符合方法学的要求。本文中建立的RP-HPLC方法简便、准确、干扰少,灵敏度高,专属性强,生物样品预处理方法能够很好的除去内源性杂质,适用于M和GL的体内药代动力学的研究及其在体内的转化过程和代谢途径的研究。2、苦参碱在大鼠体内的药代动力学初步研究本文主要考察了大鼠灌胃给予不同剂量的甘苦口服液后的血药浓度-时间曲线,组织分布和排泄。应用SPSS13.0对药代动力学参数进行统计学分析,若方差齐,应用One-WayANOVA比较高、中、低剂量组间药代动力学参数是否有统计学差异,若差异显著,则应用Bonferroni法进行两两比较;方差不齐时,应用Welch法进行方差分析,若差异显著,则应用Dunnett T3法进行两两比较。血药浓度-时间曲线实验：清洁级SD雄性大鼠15只,随机分成3组,以口服液中主要成分苦参碱计,分别按140mg·kg-1,70mg·kg-1,35mg·kg-1灌胃给与甘苦口服液,于给药后0.5,1,2,4,6,8,0,12,24h采血,应用HPLC检测各大鼠不同时间点的血浆中苦参碱的浓度,得其血药浓度-时间曲线,采用3P97药代动力学软件模拟房室模型并计算出药代动力学参数。结果表明,大鼠灌胃给予不同剂量的甘苦口服液后,动力学过程均符合二室模型。苦参碱在体内吸收迅速,Tmax为1.5h,高中低剂量组的AUC分别为98.60±8.66、37.24±6.21、17.73±3.35mg·L-1·h(p<0.001),Cmax分别为9.18±0.65、3.72±0.59、1.88±0.42mg.L-1(p<0.001),具有显著性差异；AUC与Cmax呈剂量依赖型,随给药剂量的增加而增加。组织分布实验：SD雄性大鼠20只,随机分成4组,每组5只,灌胃给药后分别于0.5,1,4,8h取各组织,匀浆后应用HPLC检测各组织中苦参碱含量,结果显示：苦参碱能迅速分布于全身各组织,在心脏和肺分布较少,在肝脏、脾脏、肾脏分布较多,而肝脾肾出现最高浓度的时间不一样,最高浓度出现在脾脏,8h时各组织中药物浓度下降迅速,提示苦参碱在组织中蓄积并不明显。排泄实验：SD雄性大鼠5只,给药后分时段收集尿液,并记录尿量。HPLC检测各大鼠不同时段尿液中M的浓度。结果显示M在48h内排泄量占给药量的27.143%,这也与文献报道中指出的M主要排泄方式为以原型从尿中排泄的结论相吻合。3、甘草甜素在大鼠体内的药代动力学的初步研究本文主要考察了GL在大鼠体内的血药浓度-时间曲线与组织分布。应用SPSS13.0对药代动力学参数进行统计学分析,若方差齐,应用One-Way ANOVA比较高、中、低剂量组间药代动力学参数是否有统计学差异,若差异显著,则应用Bonferroni法进行两两比较；方差不齐时,应用Welch法进行方差分析,若差异显著,则应用Dunnett T3法进行两两比较。血药浓度-时间曲线实验：清洁级SD雄性大鼠15只,随机分成3组,以口服液中主要成分苦参碱计,分别按140mg·kg-1,70mg·kg-1,35mg·kg-1灌胃给与甘苦口服液,于给药后1,2,4,6,8,12,24,36,48h采血,HPLC检测各大鼠不同时间点的血浆中GA的浓度。结果显示,GA在大鼠体内的药动学过程属于室模型,动力学行为基本符合线性动力学过程。GA在大鼠体内的吸收也呈剂量依赖型,高、中、低剂量组的AUC分别为40.24±7.02,21.95±2.60,11.768±2.183mg·L-1·h,(p<0.01)；Cmax分别为1.57±0.092,0.75±0.09,0.466±0.058μg·mL-1,(p<0.01),随给药剂量的增加而增加,但随剂量的增加并未影响各组的分布容积,总清除率,和达峰时间。组织分布实验：SD雄性大鼠20只,随机分成4组,每组5只,灌胃给药后分别于1,4,8,12h取各组织,匀浆后应用HPLC检测各组织GA含量,结果显示：GA在心、脾、肺、肾中含量都较低,在肝脏中含量最高,而且明显高于其他组织。肝脏中GA含量在1h较高,在4h时有所下降,随后的8h,12h均增高, GA在大鼠肝脏有两个峰浓度,这可能与GA在大鼠体内的吸收存在肝肠循环。4、苦参碱与甘草甜素在大鼠体内药代动力学上的相互影响应用SPSS13.0对参数进行统计学分析：应用两独立样本t检验,检验中剂量组与M组之间的药代动力学参数是否具有统计学差异。甘草甜素对苦参碱在大鼠体内药代动力学的影响：SD雄性大鼠5只,灌胃给予70mg·kg-1纯M(M组),于给药后0.5,1,2,4,6,8,10,12,24h采血,HPLC检测各时间点血浆中M含量,应用3P97软件对血药浓度进行拟合,得房室模型及药代动力学参数,与给予甘苦口服液70mg·kg-1中剂量组比较,结果表明：GL对于M在大鼠体内的达峰时间及AUC无影响,能够降低M等浓度,增加了M的用药安全性M对GL在大鼠体内的药代动力学的影响：SD雄性大鼠5只,灌胃给予70mg·kg-1GL(GL组),于给药后1,2,4,6,8,12,24,36,48h采血,HPLC检测各时间点血浆中GA含量,应用3P97软件对血药浓度-时间对进行拟合,得房室模型及药代动力学参数,与给予甘苦口服液70mg·kg-1中剂量组比较,结果表明：M减少了GA在大鼠体内的吸收,使GA在大鼠体内的Cmax降低,清除速率增加,表观分布容积增加,这是否有利于减轻GL诱发的假醛固酮症有待进一步的研究。从药代动力学方面来看,GL与M配伍相对单独使用,具有明显优势,首先二者的Tmax不一样,M为1.5h左右,GL为10.5h左右,二者在峰浓度上可以互补,延长药效时间,达到更好的治疗效果；其次,GL能降低M的Cmax,而不影响吸收,提高了用药安全性。