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2,3-丁二醇是一种重要的生物化学品,广泛用于化工、食品、航空航天燃料等领域。自然界中有许多微生物可以产2,3-丁二醇,如克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属和产气肠杆菌等,这些天然微生物通常产两种构型的2,3-丁二醇。依赖于不同类型2,3-丁二醇脱氢酶的存在,不同的微生物能够产不同构型的2,3-丁二醇。本实验室前期筛选到一株能产三种构型的2,3-丁二醇菌株Serratia sp.T241,该菌株具有较高的2,3-丁二醇生产能力,为了阐明该菌株合成三种构型2,3-丁二醇的机制,本论文对该菌涉及2,3-丁二醇合成的三个2,3-丁二醇脱氢酶编码基因进行了克隆和鉴定,并在大肠杆菌中进行了表达和酶学性质研究,主要结论如下:1.基于基因组序列筛选编码2,3-丁二醇脱氢酶的候选基因基于已测序的Serratia sp.AS12基因组数据,以已报道的meso-BDH(粘质沙雷氏菌)、S,S-BDH(红球菌)和R,R-BDH(多粘芽孢杆菌)的序列进行比对,从基因组序列中找到了与三个序列相似性较高的基因序列,氨基酸同源性分别达到95%、64%和62%。进一步对获得的序列进行分析,发现三个基因CDS长度为756bp、786bp和1080bp,分别编码251、261和359个氨基酸。2.meso-BDH基因的克隆、表达和催化特性研究根据1中获得的meso-BDH基因序列设计引物,成功克隆了 meso-BDH基因,测序结果与Serratia sp.AS12基因组中分析获得的meso-BDH基因序列同源性达到99%,暗示meso-BDH基因成功获得。利用pET28a表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了 meso-BDH的重组表达,并对重组酶进行了纯化。底物专一性测定显示meso-BDH重组酶能以meso-2,3-丁二醇、S,S-2,3-丁二醇、S/R-乙偶姻和双乙酰为底物,但无法催化R,R-2,3-丁二醇。催化产物分析结果表明该酶可催化R-乙偶姻与meso-2,3-丁二醇之间及S-乙偶姻与S,S-2,3-丁二醇之间的互相转化,而双乙酰为底物时生成的乙偶姻为S型。3.S,S-BDH基因的克隆、表达和催化特性研究根据1中获得的S,S-BDH基因序列设计引物,成功克隆了S,S-BDH基因,测序结果与Serratia sp.AS12基因组中分析获得的S,S-BDH基因序列同源性达到97%,暗示S,S-BDH基因成功获得。利用pET28a表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了S,S-BDH的重组表达,并对重组酶进行了纯化。底物专一性测定显示S,S-BDH重组酶能以-2,3-丁二醇、S/R-乙偶姻和双乙酰为底物,但无法催化meso-2,3-丁二醇和R,R-2,3-丁二醇。催化产物分析结果表明该酶具有较高的专一性,可催化双乙酰生成S-乙偶姻和S,S-2,3-丁二醇,同时也能催化S,S-2,3-丁二醇转化为S-乙偶姻。4.R,R-BDH基因的克隆、表达和催化特性研究根据1中获得的R,R-BDH基因序列设计引物,成功克隆了R,R-BDH 基因,测序结果与Serratia sp.AS12基因组中分析获得的R,R-BDH基因序列同源性达到97%,暗示R,R-BDH基因成功获得。利用pET28a表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了 R,R-BDH的重组表达,并对重组酶进行了纯化。底物专一性测定显示R,R-BDH重组酶能以meso-2,3-丁二醇、R,R-2,3-丁二醇、S/R-乙偶姻和双乙酰为底物,但无法催化S,S-2,3-丁二醇。催化产物分析结果表明该酶可催化R-乙偶姻与R,R-2,3-丁二醇之间及S-乙偶姻与meso-2,3-丁二醇之间的互相转化,而双乙酰为底物时生成的乙偶姻为R型。通过对Serratia sp.T241中的三个2,3-丁二醇脱氢酶基因的克隆、表达和催化特性研究,我们推导该菌中meso-2,3-丁二醇的合成由meso-BDH和R,R-BDH贡献,而R,R-2,3-丁二醇·S,S-2,3-丁二醇的合成则由R,R-BDH和meso-BDH分别催化R-乙偶姻和S-乙偶姻产生。而进一步通过基因敲除方法对三个基因进行功能确认是非常有必要的。