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研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)疾病是当今国内外发病率和病死率都较高的疾病之一。作为一种全身弥漫性的病理状态,AS是大多数心血管疾病的病理基础。炎性反应细胞及其释放的产物已被认为是最主要的促动脉粥样硬化因素。IIA类分泌型磷脂酶A2(secretory phospholipase A2group IIA, sPLA2-IIA)作为一个新近研究的重要的炎性反应介质,近年来越来越多的证据表明其在AS的发生和发展中也有重要作用。目前关于sPLA2-IIA的研究多集中在对巨噬细胞的影响以及与脂代谢的关系上,对内皮细胞的研究较少,还没有研究说明SPLA2-IIA对内皮功能的影响。内皮功能紊乱是动脉粥样硬化发生的重要始动环节,明确SPLA2-IIA的致炎效应是否会影响血管内皮功能,有助于理解sPLA2-IIA致动脉粥样硬化的机制,并有助于采取针对性的措施预防AS的发生。研究目的1.通过测定与分析多种内皮细胞分泌因子的表达水平,包括一氧化氮(nitric oxide, NO)、内皮素-1(endothelin, ET-1)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,eNOS),胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesionmolecule-1, VCAM-1),探索不同浓度的sPLA2-IIA刺激对血管内皮功能的影响。2.通过观察4-BPB (4-bromophennacyl bromide, sPLA2-IIA水解作用的抑制剂)对sPLA2-IIA诱导的内皮功能影响的变化,初步探讨sPLA2-IIA的作用机制,以了解sPLA2-IIA的水解作用是否参与了对内皮细胞的诱导作用。研究方法：1.体外分离培养人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)。2.不同浓度的sPLA2-IIA体外刺激HUVEC细胞,设置3个浓度(0.01、0.1、1ug/ml),以未加任何药物刺激培养的细胞作为空白对照,以10ng/ml TNF-α刺激培养的细胞作为阳性对照,利用试剂盒检测内皮细胞上清的一氧化氮浓度,并利用荧光定量逆转录多聚酶链反应(Real-Time PCR)方法分析一氧化氮合酶(eNOS)、内皮素-1(endothelin, ET-1)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和血管粘附分子-1(VCAM-1)的mRNA表达水平的变化,还利用Western Blot法分析ICAM-1、VCAM-1在蛋白水平的表达水平变化。3.采用体外分离培养HUVEC的方法,以1ug/ml sPLA2-IIA、10nmol/L4-BPB单独或联合刺激内皮细胞,利用试剂盒检测内皮细胞上清的一氧化氮浓度,并通过Real-Time PCR检测分析eNOS、ET-1、ICAM-1、VCAM-1转录水平的变化,用Western Blot法分析ICAM-1、VCAM-1在蛋白水平的表达变化。4.用SPSS17.0软件进行数据统计分析,组间比较用单因素方差分析(one—way ANOVA),多重比较采用LSD和SNK法。p<0.05为有统计学意义。研究结果：1.0.1ug/ml和1ug/ml的SPLA2-IIA均能诱导脐静脉内皮细胞ICAM-1、VCAM-1mRNA的表达(p<0.01),且诱导作用呈浓度依赖性(p<0.05)；并且SPLA2-IIA可上调内皮细胞ICAM-1、VCAM-1蛋白表达水平,呈浓度依赖性。2.4-BPB干预组细胞的ICAM-1、VCAM-1mRNA的表达较1ug/ml sPLA2-IIA单独刺激组显著降低(ICAM-1:0.65±0.12vs0.35±0.08, p<0.01; VCAM-1:0.85±0.14vs0.60±0.21, p<0.05),4-BPB处理也明显降低lOng/ml TNF-a诱导的ICAM-1、VCAM-1mRNA的表达(ICAM-1：0.72±0.03vs0.47±0.03,p<0.05；VCAM-1：1.24±0.04vs0.82±0.09,p<0.05)；4-BPB处理降低sPLA2-IIA或TNF-a诱导的ICAM-1、VCAM-1蛋白的表达。3.0.01ug/ml、0.1ug/ml、1ug/ml的sPLA2-IIA均能诱导脐静脉内皮细胞ET-1mRNA的表达(p<0.01),并且诱导作用呈浓度依赖性(p<0.05)；1ug/ml sPLA2-IIA能明显抑制脐静脉内皮细胞eNOS mRNA的表达(p<0.01),但浓度低于1ug/ml的sPLA2-IIA对内皮细胞eNOS mRNA的表达影响不明显(p>0.05):0. lug/ml和1ug/ml的sPLA2-IIA均能明显抑制内皮细胞NO的生成(P<0.05, p<0.01)。4.4-BPB处理明显减弱1ug/ml sPLA2-IIA调节的ET-1、eNOS mRNA的表达(ET-1：1.52±0.06vs1.13±0.06, p<0.01; eNOS:-0.38±0.01vs-0.15±0.02,p<0.05)：4-BPB处理也明显减弱lOng/ml TNF-a调节的ET-1、eNOS mRNA的表.达(ET-1:1.89±0.00vs1.38±0.05, p<0.01; eNOS:-1.52±0.12vs-0.96±0.04,p<0.01),但是4-BPB处理对sPLA2-IIA及TNF-α抑制内皮细胞NO生成的作用不明显(P>0.05)。结论：1. sPLA2-IIA能剂量依赖性地诱导内皮细胞ICAM-1、VCAM-1、ET-1的表达,抑制eNOS的表达,减少NO的生成。2. sPLA2-IIA的水解作用是其影响内皮细胞ICAM-1、VCAM-1、ET-1和eNOS表达的机制之一。3. TNF-α诱导内皮细胞表达ICAM-1、VCAM-1、ET-1、eNOS的过程中可能有sPLA2-IIA的活化和参与。