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大叶藻(Zostera marina)属于大叶藻属(Zostera L.)海洋高等被子植物,生活在含盐量高达600 mmol/L的海水中,被认为耐盐性很高,这表明大叶藻是研究耐盐基因及耐盐机理的绝佳材料。Na+/H+逆向转运蛋白在植物耐盐性方面具有重要作用,可以将细胞质内过量的Na+排出细胞或区隔化到液泡中,减少盐离子特别是Na+对细胞的毒害,提高植物耐盐性。本文从大叶藻中成功克隆出液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(Zom NHX2基因)并对其进行生物信息学分析,通过半定量RT-PCR技术探讨该基因的组织表达特异性。建立苹果组织培养再生体系,为将进一步构建表达载体用于苹果遗传转化,验证液泡膜Zom NHX2基因的功能奠定基础。具体结果如下:1.根据genbank中的序列信息设计特异性引物,通过RT-PCR技术克隆得到大叶藻Zom NHX2基因,长度为1 626 bp,可编码541个氨基酸。预测蛋白分子量为59.5 k Da。2.氨基酸序列比对分析表明,大叶藻Zom NHX2与其他植物的Na+/H+逆向转运蛋白具有较高同源性,其中与马蔺具有最高的同源性。同源比较发现大叶藻Zom NHX2具有Na+/H+逆向转运蛋白基因典型的氨氯吡嗪结合位点保守区域(LFFIVLLPPI)。二级结构预测显示,Zom NHX2的二级结构以α螺旋为主。疏水性分析表明,Zom NHX2的N端具有很强的疏水性,C末端具有较强的亲水性,整个蛋白表现为疏水性。跨膜结构分析推测,Zom NHX2蛋白具有10个跨膜结构域。系统发育树显示大叶藻与马蔺的亲缘关系较近。3.利用半定量RT-PCR技术对大叶藻Zom NHX2基因在茎和叶中的表达特异性进行分析,发现该基因在叶中表达量高于其在茎中表达量。4.建立苹果再生体系。外植体根、茎、叶和子叶在激素诱导下只能形成愈伤组织,而胚芽经MS+KT(1 mg/L)+NAA(0.2 mg/L)培养基的诱导可高效再生丛生芽。为获得完整幼苗进行生根试验,筛选出最适生根的培养基为1/2MS+NAA(0.2mg/L)。5.苹果幼苗耐盐性研究发现苹果幼苗的盐害率随着Na Cl浓度的升高而升高,随着胁迫时间的延长而升高。建议选用4 g/L-8 g/L的Na Cl处理转基因苹果幼苗进行耐盐性分析。