目的:1.筛选和优化诱导白及愈伤组织的最优培养基配方;2.观察白及愈伤与内生真菌共生培养的过程,分析内生真菌对白及次生代谢物合成的影响;3.检测白及愈伤组织在悬浮培养过程中不同阶段的SNP。方法:1.正交试验方法优化白及诱导培养基:利用2因素3水平正交试验共设计出培养基类型,将所得到的无菌白及种子转入这9种培养基中,在培养50天之后计算愈伤组织的诱导率。Box-Benhnken响应面法优化白及愈伤的增殖培养基:根据BBD试验设计原理,确定BBD试验因子为不同浓度的6-BA、2,4-D和NAA,响应值为愈伤组织增殖率,设计响应面试验。并从诱导培养基中挑选出疏松、嫩黄的愈伤组织,接种在13种增殖培养基中,20天后计算愈伤增殖率。2.白及内生真菌与愈伤组织共培养之后次生代谢产物的成分测定:一共挑选了8株在PDA培养基中生长状态和颜色不一样的内生真菌,与白及愈伤一起共同接种到愈伤增殖的优选培养基中进行共培养。在培养生长的过程中,观察内生真菌的生长状态和白及愈伤组织的褐化程度以及共培养状态下白及愈伤组织与内生真菌的接触程度。而且分别在3dai、6dai、9dai从共培养的培养基中取出愈伤组织,用70%甲醇抽提旋蒸之后定容至5 mL,然后利用高效液相色谱仪测定次生代谢产物在这共培养的9天之中的变化情况。3.将前述诱导的白及愈伤转接到液体培养基中进行悬浮培养,从接种开始到培养的45天,每隔3天采集愈伤细胞提取其总RNA。取等量RNA混合成一个样用于三代的全长转录本测序,构建成1个Reference。再对各个样分别进行二代的RNA-Seq测序,并将测序结果比对到Reference中,检测样本间的SNP情况。结果:1.以白及种子为外植体,用正交试验的方法得到白及愈伤组织诱导培养的优化培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2,4-D+6.0 g/L琼脂+30 g/L蔗糖,并且在正交试验诱导愈伤基础上,根据Box-Benhnken(BBD)试验设计原理,采用3因素3水平的方法对3个激素的不同浓度水平进行组合试验。结果显示通过回归模型分析获得增殖诱导的优化培养基为MS+0.801 mg/L 6-BA+1.192 mg/L2,4-D+0.724 mg/L NAA+6.0 g/L琼脂+30 g/L蔗糖。2.选取第三次继代且生长状态良好的愈伤组织与白及内生真菌进行共培养,分别选取3dai、6dai、9dai测定次生代谢产物的含量。通过次生代谢产物含量的测定发现,编号为1-56的内生真菌对对羟基苯甲醇的含量影响最大,并且在6dai时,对羟基苯甲醇的含量是对照组的2.5倍。编号为1-56和3-4的内生真菌对dactylorhin A的含量有明显的影响。编号为1-42的内生真菌对militarine的含量在9dai时比对照组的militarine的含量稍高。而编号为3-4的内生真菌对coelonin的含量影响最明显。3.选取了悬浮培养10个时间点的样本进行三代和二代的RNA测序,共检测到了241,570个SNP位点。从类型上看,检测到的SNP位点主要分为转换和颠换两种形式,其中转换共有78,184个,颠换共有41,062个,最多的为转换的C/T型,达到44,248个。从数量上进行分析,在3dai时,Homo(纯合子变异位点)位点最低为18 411个,第33天时最高为41 430个,平均为29 920个。Heter(杂合子变异位点)位点最低为3dai时5,340个,最高为9dai时14,711个,平均为10,007个。结论:本研究以白及愈伤组织为桥梁,通过正交试验和响应面试验方法分别成功优化了白及愈伤组织诱导培养基和继代培养基类型。并且选择了8株白及内生真菌与愈伤组织进行共培养,通过次生代谢产物含量的测定,初步筛选了可以刺激白及次生代谢产物含量有明显变化的内生真菌。并且,最后成功将SNP数据进行了数量和类型上的比对和分析。