NFBD1(nuclear factor with BRCT domains protein 1),也称为MDC1(mediator of DNA damage checkpoint protein 1),是一个参与DNA损伤应答反应的重要分子;近年来的研究也提示其可能参与肿瘤的发生发展。本论文主要就NFBD1/MDC1在宫颈癌中的表达及其对细胞生长、细胞周期、凋亡等的调节进行研究,并初步探索其分子机制。分述以下五个部分:(1)NFBD1在宫颈癌标本中的表达检测:应用real time PCR对39例宫颈癌及其对应正常宫颈组织中NFBD1 mRNA的表达进行检测,结果有24例(61.5%)宫颈癌组织中NFBD1 mRNA的表达高于对应正常宫颈组织。应用免疫组织化学方法对60例宫颈癌及其对应宫颈正常组织NFBD1蛋白质的表达进行检测,结果有42例(70%)宫颈癌组织中NFBD1蛋白质的表达高于对应的正常宫颈组织。NFBD1在宫颈癌及其对应正常宫颈组织中的表达差异提示NFBD1可能在宫颈癌的发生发展中具有一定的作用。(2)NFBD1 shRNA逆转录病毒载体的构建及逆转录病毒的制备:用pSilencer5.1 H1-Retro作载体,将合成的NFBD1 shRNA片段插入该载体,构建含NFBD1 shRNA的重组质粒;经测序确认后,用脂质体2000将重组质粒分别转染到HeLa、SiHa、CaSki宫颈癌细胞系中,72小时后用RT-PCR方法检测NFBD1在mRNA水平的表达变化;选择在mRNA水平具有较好干扰效果的重组质粒用脂质体2000转染到逆转录病毒包装细胞PT67中进行逆转录病毒的制备;收集逆转录病毒并感染HeLa、SiHa、CaSki宫颈癌细胞,72小时后将感染病毒的一部分细胞用RT-PCR、Real time PCR、Western Blot方法对NFBD1在mRNA及蛋白质水平的表达变化进行检测,结果与阴性对照组及未处理组比较,发现NFBD1 shRNA组在mRNA及蛋白质水平NFBD1的表达显著降低,这说明用逆转录病毒介导NFBD1 shRNA能有效抑制NFBD1的表达。同时,构建表达EGFP的pBABE重组逆转录病毒载体并转染PT67细胞进行逆转录病毒包装,收集该病毒并感染HeLa、SiHa、CaSki细胞,结果在荧光显微镜下均观察到EGFP的表达,这也说明制备的逆转录病毒能感染HeLa、SiHa、CaSki细胞并在细胞中得以表达。(3)NFBD1表达下调对宫颈癌细胞生长、细胞周期、凋亡及阿霉素敏感性的影响:逆转录病毒感染HeLa、SiHa、CaSki细胞后,用MTT法检测细胞生长增殖并绘制生长曲线,与阴性对照组及未处理组比较,发现NFBD1 shRNA组的细胞生长明显减慢,显微镜下也观察到细胞生长的减慢,这说明逆转录病毒介导NFBD1 shRNA能抑制HeLa、SiHa、CaSki细胞的生长。用FACS检测逆转录病毒感染72小时后的HeLa、SiHa、CaSki细胞,与阴性对照组及未处理组比较,发现NFBD1 shRNA组中G2/M期细胞明显增多,凋亡细胞增多,表明NFBD1的表达下调能阻滞细胞于细胞周期的G2/M期,同时诱发细胞凋亡。逆转录病毒感染细胞36小时后,用阿霉素(ADR)处理细胞,48小时后用MTT法检测细胞生存情况,与未处理组及阴性对照组比较,结果发现NFBD1 shRNA组存活细胞明显减少,表明NFBD1的表达抑制能增强HeLa、SiHa、CaSki细胞对化疗药物阿霉素的敏感性。(4)稳定表达NFBD1 shRNA的HeLa细胞系建立及NFBD1 shRNA对裸鼠移植瘤的抑制作用:用逆转录病毒感染HeLa细胞,并用嘌呤霉素(puromycin)筛选;挑选单克隆细胞并扩大培养,建立稳定细胞系后用RT-PCR、Western Blot方法对NFBD1在mRNA及蛋白质水平的表达抑制进行检测确认。在裸鼠皮下接种稳定表达NFBD1 shRNA的HeLa细胞,观察肿瘤生长,测量肿瘤长短径,计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线;39天后处死裸鼠,制作肿瘤切片,对切片进行TUNEL检测和电镜超微结构观察。结果与未处理组及阴性对照组比较,发现NFBD1 shRNA组肿瘤生长显著减慢,肿瘤重量明显减轻;TUNEL检测发现细胞明显凋亡,电镜下观察到多个凋亡小体,表明NFBD1的表达下调能抑制裸鼠体内肿瘤生长,并诱发细胞凋亡。(5)NFBD1表达下调对细胞周期、细胞凋亡影响的机制研究:进一步用M期特异性的分子标志物磷酸化的Histone H3抗体检测发现NFBD1表达下调的HeLa细胞中,磷酸化的Histone H3表达亦明显减少,表明NFBD1 knockdown引起的G2/M期阻滞主要是阻滞在G2期,其机制可能是DNA损伤激活G2/M期检查点途径,主要涉及CDC25C-CyclinB1/CDC2通路;NFBD1表达下调诱发的凋亡主要由P53-Cytochrome C-Caspase 3途径介导。