大肠杆菌入侵土壤的机制及其与土著微生物的互作关系

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全球畜禽养殖业的发展产生了大量的畜禽粪便,其中未经有效灭菌的畜禽粪便直接作为有机肥料施用于农田系统中可造成病原微生物污染,可迁移至水体、蔬菜、动物体内等,进而引发人类或其他动物的疾病传播、暴发。大肠杆菌O157:H7是一种常见的人畜共患的病原微生物,10个细胞量即可导致人体感染,可对人体造成严重的并发症。土著微生物作为土壤生命的重要组成部分,种类繁多、数量庞大且功能多样,可在土壤受到外来微生物入侵时作出响应。因此了解大肠杆菌O157:H7入侵后与土著微生物的互作以及该菌携带的毒素基因对群落的影响,将有助于了解土壤生物污染的机理和效应,为探究其治理方案奠定理论基础,对深入理解“土壤健康”、“土壤微生态安全”具有重要的意义。本论文通过实验室内培养实验,研究了不同土壤类型及外源底物添加对土壤中大肠杆菌O157:H7存活时间的影响及主要的驱使因子,阐明了大肠杆菌O157:H7入侵后对土著群落的遗留效应及关键影响因子,揭示了土著群落受外来微生物入侵时的群落功能层面的响应以及特异微生物的筛选、互作效应等。主要研究结果如下:(1)土壤性质对大肠杆菌O157:H7存活的影响。在土壤的非生物、生物因素中,p H值、微生物多样性以及资源可利用性是大肠杆菌存活的重要驱动因素。随着土壤p H值的升高(4.30±0.55至7.23±0.12),大肠杆菌O157:H7存活时间增长;土著微生物多样性越高,大肠杆菌O157:H7的存活时间越短;土壤的资源可利用性越高,大肠杆菌O157:H7存活时间越长。此外,毒素基因对大肠杆菌O157:H7的入侵存活时间有显著影响,携带所有毒素基因的菌株存活时间最短(最低为砖红壤4.59±0.13天),无毒菌株存活时间最长(最高为棕壤118.34±2.38天)。养分输入可导致土著群落与入侵微生物之间的资源竞争等相互关系发生改变,最终提高大肠杆菌O157:H7的入侵率。(2)大肠杆菌O157:H7入侵对土壤群落稳定性的影响机制。高通量测序以及Biolog分析结果表明,大肠杆菌O157:H7入侵后对土著微生物的组成、结构、碳源利用能力以及群落生态位等产生了遗留效应。大肠杆菌O157:H7入侵后,土著生态位显著增加(10-1群落增加约1.13倍,10-6群落增加约3.66倍),群落的代谢能力发生变化,携带不同毒素基因的大肠杆菌O157:H7菌株入侵后对土著群落的影响不同,携带所有毒素基因的菌株入侵后土著群落受到病原微生物入侵后恢复较快,而无毒菌株入侵后土著群落在监测时间范围内(120天)未观察到显著的恢复。统计分析结果显示,大肠杆菌O157:H7的存活时间与所有土壤处理组的群落变化Bray-curtis距离呈显著正相关,表明大肠杆菌O157:H7入侵对土著微生物的影响主要取决于其在土壤中的存活时间。(3)大肠杆菌O157:H7入侵对土著微生物稳定性的影响机制。通过伽马辐照灭菌处理探究了大肠杆菌O157:H7的存活时间及其与土著微生物的响应。结果表明,大肠杆菌O157:H7的存活与土著微生物之间的竞争密切相关,大肠杆菌O157:H7入侵能显著改变土壤有机碳的矿化速率(灭菌土壤提高约1.26倍,自然土壤提高约1.30倍),外来碳源的添加可显著提高土壤的呼吸作用,且对伽马灭菌土著微生物的恢复有着显著的影响。由此可知,土著微生物在抵抗外来微生物入侵过程中起着重要的作用。(4)微杆菌Microbacterium foliorum(M.foliorum)对土壤中大肠杆菌O157:H7存活时间的影响。从土著微生物中筛选出40株基因型与功能型不同的土壤细菌,进一步探索大肠杆菌O157:H7与土壤细菌间相互作用的可能性。研究发现微杆菌M.foliorum与大肠杆菌O157:H7在单独培养状况下均无法利用纤维二糖,而在共培养体系中可直接利用纤维二糖进行细胞增殖,但该共培养体系不能增加大肠杆菌O157:H7在葡萄糖、麦芽糖中的存活量,证明大肠杆菌O157:H7与微杆菌M.foliorum对碳源底物的的协同作用不具有普遍性。此外,微杆菌M.foliorum可促进不同营养条件下大肠杆菌O157:H7生物膜的生长。土壤中微杆菌M.foliorum与大肠杆菌O157:H7共存时,添加纤维二糖可显著延长大肠杆菌O157:H7在土壤中的存活时间(延长约1.67倍),进而提高了入侵的风险性。
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