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第一部分间充质干细胞来源的细胞外囊泡分离鉴定和巨噬细胞摄取情况研究目的:脂肪来源间充质干细胞(Adipose mesenchymal stem cells,ASC)可向细胞外分泌丰富的细胞外囊泡,ASCs可减轻LPS诱导的肺损伤,其部分的作用可能通过EVs实现的。作为肺组织内的免疫细胞巨噬细胞如何受其影响,是否摄取EVs未见报道。本部分研究主要通过超速离心获取EVs并进一步鉴定,在体和离体实验证明巨噬细胞摄取一定量的EVs。为下一步证明EVs在LPS诱导的急性肺损伤发生发展中的作用。研究方法:收集培养的MSCs细胞上清采用差速超离的方法获得EVs,并用国际上标准的方法鉴定。将人单核细胞系THP-1细胞和CD63标志带荧光的EVs共培养,24h后荧光电镜观察;将用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激细胞骨髓来源的巨噬细胞诱导成熟(BMDM),与经CD63标志带荧光的EVs共培养,6h后流式细胞仪观察巨噬细胞摄取的情况;采用LPS诱导气管内滴入WT(C57BL/6)小鼠致肺损伤模型,造模后将用DID标志过的EVs气管内滴入,24 h后观察流式细胞仪检测肺泡灌洗液中巨噬细胞里DID阳性比例。研究结果:透射电镜的结果显示MSC-EVs如杯托状,大小为50-150 nm,DLS显示峰值在106 nm左右,显示超离出的是包括外泌体和微囊泡的成分;用BCA蛋白定量,NTA检测,显示大约2.36±0.63×108颗粒/μg,每个间充质干细胞大约在24h内可分泌417±156个颗粒;MSC-EVs表面表达外泌体的标志如CD63和CD81,微囊泡的标志CD40和MSCs的标志CD105和CD44,而不表达GM130(高尔基体)和calnexin(内质网);荧光电镜显示THP-1摄取EVs,约40%的BMDM摄取EVs,体内实验,24 h流式分析约70%的巨噬细胞EVs阳性(F4/80+DID+)。研究结论:ASCs分泌的细胞外囊泡可被分离鉴定,并被人单核细胞和巨噬细胞摄取。第二部分间充质干细胞来源的细胞外囊泡减轻急性肺损伤的研究研究目的:通过第一部分研究发现,ASCs的细胞上清可超离到丰富的EVs,并且这些EVs可被巨噬细胞在6-24 h内摄取,本部分通过离体细胞培养和在体细胞实验,探讨巨噬细胞摄入EVs后,是否影响炎症因子释放进而减轻急性肺损伤的分子机制。研究方法:将C57BL/6-8周野生鼠获取的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激细胞骨髓来源的巨噬细胞诱导成熟(BMDM)与EVs共培养,qRT-PCR分析巨噬细胞里炎症因子的表达水平及M2巨噬细胞的表面标志的表达情况。分析巨噬细胞的吞噬细菌的功能情况,将Alexa Fluor 594偶联大肠杆菌(E.coli.)用于吞噬实验,流式分析吞噬荧光强度的变化。将C57BL/68周野生鼠以LPS气管内滴入LPS造成急性肺损伤模型,30min后MSCs静脉注射,EVs气管内滴入(IT)或静脉注射(IV),48 h后HE染色看肺组织的损伤情况,收集肺泡灌洗液(BALF),分析蛋白含量,细胞数,中心粒细胞数等,流式分析M2巨噬细胞表面标志CD206表达百分比,CBA试剂盒分析BALF炎症因子变化,BALF贴壁获得巨噬细胞,RT-PCR分析细胞因子和细胞极化因子的表达,Western blot分析肺泡巨噬细胞中NFKB1蛋白的表达。研究结果:体外培养的BMDMs结果显示EVs共培养LPS刺激组IL-6,IL-1β,和TNF-α的mRNA表达与LPS组相比明显下降(p<0.05)。M1巨噬细胞表面标志i NOS下降而M2型表面标志物YM-1和CD206上升(p<0.05),表明MSC-EVs可以使巨噬细胞向M2极化。流式分析表明,MSC-EVs+LPS与LPS组相比,MSC-EVs+LPS组吞噬能力增强(p<0.05)。体内动物实验表明MSCs组、EVs IV组、EVs IT组可减轻炎症细胞的浸润,细胞隔的增厚,肺血管内皮的通透性增加(通过肺泡灌洗液中蛋白量的增加来体现)(p<0.05)。MSCs IV、EVs IV、EVs IT组BALF总蛋白分别下降26.0%,38.2%和32.0%,细胞数目分别下降33.9%,49.0%和40.4%(p<0.05),中性粒细胞下降37.6%,48.0%和43.5%(p<0.05),但当我们将EVs的剂量减少一半时其作用将没有被体现。MSCs IV,EVs IV和EVs IT组肺泡灌洗液CBA分析IL-1β,IL-6和TNF-α下降(p<0.05),但治疗组之间没有明显差别。MSCs,EVs IV和EVs IT组分离的肺泡巨噬细胞用qRT-PCR分析M1/M2极化现象,三组之间有一些不同的趋向,但总体是降低促炎因子的表达,升高抑炎因子和M2表面标志的表达。Western blot显示LPS刺激引起的急性肺损伤后NFKB1表达上升,EVs IV或IT治疗后表达下降。研究结论:MSC-EVs可在体外抑制巨噬细胞的活化,促进其向M2极化;MSC-EVs静脉注射和气管内滴入均可促进肺泡巨噬细胞向M2型极化,进而减少炎症因子的释放,抑制中性粒细胞的招募,减轻急性肺损伤。第三部分间充质干细胞通过细胞外囊泡传递miR-27a-3p至巨噬细胞减轻急性肺损伤研究目的:结合第一部分和第二部分的研究,动物实验及体外研究均表明MSCs来源的EVs可以调控巨噬细胞起到抑炎作用。既往研究表明MSCs来源的EVs可通过转移其内容物如micro RNA(miRNA)至靶细胞,miRNA可在转录后水平调控基因的表达,改变靶细胞的功能状态。因此,本部分用低表达miRNA的慢病毒,体内气管内转染肺和体外转染BMDMs,研究该miRNA的功能;及拟用低表达miRNA的慢病毒转染MSCs,研究MSCs是否通过EVs转移miRNA至巨噬细胞发挥调控作用,低表达miRNA的MSCs其EVs的减轻急性肺损伤的作用是否会被部分取消。从而探讨MSCs来源的EVs是否传递了miRNA至巨噬细胞减轻急性肺损伤。研究方法:将THP-1细胞和MSCs用transwell板共培养,LPS刺激,与只用LPS刺激的THP-1比较,微数列芯片分析两者之间micro RNA表达的差异,筛选出共培养后表达明显增加的micro RNA。其中miR-27a-3p表达明显上升位列第二(第一位被认为与肿瘤更相关),根据文献报道和炎症调节相关,将EVs和THP-1及BMDMs共培养,检测细胞中miR-27a-3p表达是否上升。体内实验检测MSCs、EVs IV和EVs IT组治疗LPS引起的急性肺损伤其肺泡巨噬细胞中miR-27a-3p表达是否上升。低表达miR-27a-3p的慢病毒转染BMDMs然后与EVs共培养,其促进巨噬细胞M2极化是否会被部分抵消。检测体内低表达miR-27a-3p慢病毒气管内滴入转染肺,并观察EVs的治疗效果。低表达miR-27a-3p的慢病毒转染MSCs分离的EVs其治疗急性肺损伤作用的效果。根据生物信息学,Targetscan,micro RNA.org,Mi RDB等网站预测miR-27a-3p的靶点,双荧光素酶报告基因实验证明。以低表达miRNA慢病毒转染MSCs,分离的EVs来治疗的肺损伤小鼠,qRT-PCR和Western Blot分析肺泡巨噬细胞中NFKB1的表达情况。研究结果:miRNA芯片显示首位升高的是miR-1260b,但文献显示和肿瘤相关性更好,miR-27a-3p列第二位,被报道和M2极化相关。同时有研究显示miR-27a在MSCs高表达,人与鼠其miR-27a-3p成熟体序列一致,所以选择miR-27a-3p为研究对象。进一步验证THP-1、BMDMs和MSCs transwell共培养或和EVs共培养miR-27a-3p表达上升,miR-27a-3p在BMDMs中LPS刺激24h后表达下降,其前体pri-miR-27a下降(p<0.05)。MSCs IV,EVs IV和EVs IT治疗组与LPS刺激引起的急性肺损伤组相比,肺泡巨噬细胞miR-27a-3p表达上升,LPS刺激肺泡巨噬细胞miR-27a-3p表达下降和体外一致。Target Scan和microrna.org预测miR-27a-3p的靶点之一可能是NFKB1。低表达miR-27a-3p的BMDMs抵消了MSC-EVs对IL-1β,IL-6,i NOS,CD206的作用,同时吞噬能力也下降(p<0.05)。体内低表达miR-27a-3p慢病毒气管内滴入转染肺,EVs的治疗效果下降,流式分析肺泡灌洗液中巨噬细胞CD206的比例下降,巨噬细胞炎症因子分泌增加,M2表面标志减少(p<0.05)。低表达miR-27a-3p的慢病毒转染MSCs分离的EVs体内治疗效果下降,巨噬细胞炎症因子分泌增加,M2表面标志减少(p<0.05),qRT-PCR显示NFKB1表达上升(p<0.05),Western Blot显示NFKB1蛋白表达上升(p<0.05)。双荧光素酶报告基因实验证明miR-27a-3p的靶点之一是NFKB1。研究结论:间充质干细胞可通过EVs传递miR-27a-3p至巨噬细胞。低表达miR-27a-3p的巨噬细胞M2极化被部分抵消。气管内转染低表达miR-27a-3p慢病毒,肺泡巨噬细胞M2极化被部分抵消,加重急性肺损伤。低表达miR-27a-3p的MSC-EVs,其减轻急性肺损伤作用被部分抵消,miR-27a-3p参与了MSC-EVs的减轻急性肺损伤的作用。miR-27a-3p的靶蛋白之一为NFKB1。