论文部分内容阅读
诱导多功能干细胞（iPS），具有和胚胎干细胞类似的发育多潜能性，由于其避开了胚胎干细胞研究面临的伦理和法律等问题，在生物学和医学领域具有广阔的应用前景。目前有关缺氧/低氧对iPS细胞的生物学功能的影响尚不清楚。iPS对肾缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury，IRI)有否治疗作用，目前尚无报道。目的本工作拟在iPS细胞，研究缺氧对iPS细胞的增值、迁移、黏附、凋亡以及基因表达等的影响；进而用缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）siRNA转染iPS细胞，观察降低HIF-1α表达后，缺氧对iPS细胞作用的影响；建立小鼠急性肾缺血模型，观察iPS细胞是否对肾缺血再灌注损伤有保护作用。方法应用逆转录病毒载体向原代培养的MEF细胞导入Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc四种基因，诱导出iPS细胞。iPS细胞实验分为四组：①常氧（Normoxia）组、②缺氧（Hypoxia）组、③缺氧+转染随机序列siRNA（Hypoxia+con siRNA）组、④缺氧+转染HIF-1a siRNA（Hypoxia+HIF-1a siRNA）组，向③④组iPS细胞分别转染con siRNA和HIF-1a siRNA，然后将②③④同时置缺氧盒里缺氧处理12小时，应用real-time PCR、流式细胞仪等技术检测各组iPS细胞的基因表达、凋亡、增殖、迁移、粘附等情况。动物实验：建立肾缺血再灌注模型，采用摘除右肾，左肾动静脉扎闭50分钟的方法，分别向各组左肾包膜内注射以下不同处理过的iPS细胞:常氧iPS细胞、低氧处理iPS细胞、低氧+con siRNA iPS细胞、低氧+HIF-1a siRNA iPS细胞和PBS，观察上述iPS细胞干预对肾缺血再灌注损伤的影响。结果1缺氧及HIF-1a对iPS细胞增殖的影响：与常氧组（1±0）相比，Hypoxia组（0.86±0.04）iPS细胞数明显下降，下降至缺氧前的86±4%，P<0.05；与阴性对照Hypoxia+con siRNA组(0.87±0.03)相比，Hypoxia+HIF-1a siRNA组(0.77±0.02)iPS细胞数明显下降，P<0.05。以上结果表明缺氧可抑制iPS细胞增殖，降低HIF-1a表达加重缺氧对iPS细胞增殖的抑制作用。2缺氧及HIF-1a对iPS细胞迁移的影响：与常氧组（1±0）相比，Hypoxia组迁移细胞数比常氧组明显增多,为3.96±0.84,P <0.05；Hypoxia+HIF-1a siRNA组为1.22±0.04,比Hypoxia+con siRNA组（4.12±1.11）明显减少，P <0.05,表明缺氧促进iPS细胞迁移，降低HIF-1a表达可抑制缺氧对iPS细胞迁移的促进作用。3缺氧及HIF-1a对iPS细胞穿内皮迁移的影响：与常氧组1±0相比，Hypoxia组穿内皮迁移的iPS细胞数明显减少，为0.56±0.10，P <0.05；与Hypoxia+consiRNA （0.70±0.19）相比，Hypoxia+HIF-1a siRNA组上升为1.19±0.19，P <0.05，有统计学差异；表明缺氧抑制iPS细胞穿内皮迁移，降低HIF-1a表达可抑制缺氧对iPS细胞穿内皮迁移的作用。4缺氧及HIF-1a对iPS细胞黏附的影响：常氧组为1±0，与其相比Hypoxia组降低为0.60±0.09，P <0.05，有统计学差异；Hypoxia+con siRNA组为0.75±0.10，与其相比Hypoxia+HIF-1a siRNA组上升为1.41±0.15，P <0.05，有统计学差异；说明缺氧抑制iPS细胞粘附，降低HIF-1a表达可减弱缺氧抑制iPS细胞的粘附作用。5缺氧及HIF-1a对iPS细胞与内皮细胞黏附的影响：常氧组iPS细胞与内皮细胞粘附经标准化处理为1±0，Hypoxia组为0.73±0.10，与常氧组相比Hypoxia组明显下降，P <0.05，有统计学差异；Hypoxia+con siRNA组为0.82±0.08，与其相比Hypoxia+HIF-1a siRNA组上升为1.20±0.16，P <0.05；以上结果表明，缺氧抑制iPS细胞与内皮细胞的粘附，降低HIF-1a表达可减弱缺氧抑制iPS粘附的作用。6缺氧及HIF-1a对iPS细胞凋亡的影响：常氧组早期凋亡为11.28±1.34，与常氧组相比Hypoxia组上升为14.23±2.98，P≥0.05，没有统计学差异；Hypoxia+con siRNA组为19.95±4.22，与其相比，Hypoxia+HIF-1a siRNA组降低为16.22±1.44，P≥0.05，没有统计学差异。常氧组晚期凋亡为5.35±1.09，Hypoxia组上升为6.63±0.14，与常氧组相比P≥0.05，没有统计学差异；Hypoxia+con siRNA组为16.18±1.19，与其相比，Hypoxia+HIF-1asiRNA组降低为14.26±0.62，P <0.05，有统计学差异。以上结果表明缺氧对iPS细胞早期凋亡和晚期凋亡没有显著作用；但降低HIF-1a，可在一定程度上抑制晚期凋亡。7缺氧处理iPS细胞12小时，SOD1、FGFR2、CCS、TEK、PLAU、NME4、MTA2基因的RNA表达明显下降，降低iPS细胞HIF-1a表达可抑制缺氧对iPS细胞上述基因的作用。8缺氧及HIF-1a对iPS细胞在缺血再灌肾脏中迁移的影响：与正常iPS组（1±0）相比， Hypoxia组（1.56±0.33）iPS细胞在损伤肾脏中迁移距离明显增长，且P<0.05；与Hypoxia+con siRNA组（1.37±0.21）相比Hypoxia+HIF-1a siRNA组（0.6±0.21）iPS细胞在缺血再灌注肾脏中的迁移距离明显缩短，且P<0.05，这与上文中iPS细胞体外迁移实验结果是一致的。9iPS细胞对缺血再灌注损伤肾脏肾功能的影响：与PBS组（134.95±16.75）相比，正常iPS组（216.66±27.87）小鼠血清肌苷升高；与正常iPS组（216.66±27.87）相比，Hypoxia组血清肌苷下降明显，为40.21±40.58，P<0.05，有统计学差异；与Hypoxia+con siRNA组（112.64±29.81）相比，Hypoxia+HIF-1a siRNA组血清肌苷值有明显上升，为153.71±25.26。以上结果表明：肾包膜下注射缺氧处理的iPS细胞，可降低缺血再灌注损伤肾脏小鼠的血清肌苷值；降低缺氧iPS细胞HIF-1a表达可抑制缺氧iPS细胞降低肌苷值的作用。结论1．缺氧处理12小时可抑制iPS细胞增殖；降低iPS细胞HIF-1a表达可加重缺氧对iPS细胞增殖的抑制作用。2．缺氧处理12小时可促进iPS细胞迁移；降低HIF-1a表达，可明显抑制缺氧促进iPS细胞迁移的作用。3．iPS细胞可自由穿过内皮细胞；缺氧处理可明显抑制iPS细胞穿内皮细胞迁移；降低HIF-1a表达又会逆转缺氧抑制迁移的现象，促进iPS细胞穿内皮迁移。4．缺氧处理12小时，对iPS细胞早期凋亡和晚期凋亡没有显著作用；但转染HIF-1a siRNA降低缺氧诱导因子表达后，可在一定程度上抑制晚期凋亡。5．缺氧处理iPS细胞明显抑制iPS细胞与iPS细胞黏附以及iPS细胞与内皮细胞的粘附，降低缺氧诱导因子表达能逆转此效应。6.缺氧处理可抑制iPS细胞SOD1、FGFR2、CCS、TEK、PLAU、NME4、MTA2等基因的RNA表达，降低iPS细胞HIF-1a表达能抑制缺氧对iPS细胞上述基因表达的影响。7.缺氧处理能促进iPS细胞在小鼠缺血肾脏中的迁移，降低HIF-1a表达后，iPS细胞迁移距离相对缩短。8.肾包膜下给予缺氧处理过的iPS细胞，与PBS组以及正常iPS组相比，小鼠血清肌酐值明显下降，表明缺氧处理过的iPS细胞能改善缺血再灌注损伤肾脏的功能。9. iPS细胞可明显减小缺血再灌注损伤肾脏缺血面积；降低缺氧处理的iPS细胞的HIF-1a表达，可抑制缺氧iPS细胞对缺血再灌注肾脏的作用。