理气开郁法板块方的抗炎作用及其机理研究

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目的:本实验通过观察金铃子散、痛泻要方、芍药甘草汤、柴郁汤四种中药复方制剂的抗炎作用以及采用血清药理学的方法探讨四种中药制剂对致炎的中性多形核白细胞(polymorphonuclear 1eukocytes,PMN)的抗炎作用,用以证实四种中药制剂对实验性大鼠体内外的抗炎作用,为其研发和临床应用提供实验依据。方法:实验一观察四种中药复方制剂对1%角叉菜胶引起的大鼠足肿胀的抑制作用:清洁级Wistar大鼠153只按体重进行随机区组分组,分为15组:正常组,模型组,氢化可的松组,金铃子散低、中、高剂量组,痛泻要方低、中、高剂量组,芍药甘草汤低、中、高剂量组,柴郁汤低、中、高剂量组。第一天对大鼠称重,编号,分组,第二天、第三天用改良的鼠足容积测定器测定正常状态下,大鼠右后足趾的容积,第四天早上正常组灌胃蒸馏水,模型组灌胃蒸馏水,氢化可的松组灌胃氢化可的松溶液,四种中药复方制剂低、中、高剂量组分别灌胃对应的低、中、高剂量的四种中药复方制剂。第五天至第九天灌胃给药,剂量同第四天,第九天灌胃给药后,将大鼠右后肢拉直,用1ml注射器先自足趾中部皮下向上注入一部分1%角叉菜胶溶液,然后掉转头向下注完,每只0.1ml,正常组除外。分别于注入前及注入后0.5h、1h、2h、4h、6h,测定大鼠右后致炎足肿胀程度(容积)。实验二观察四种中药复方制剂对巴豆油混合致炎剂引起的小鼠耳肿胀的抑制作用:清洁级昆明种小鼠150只,按体重进行随机区组分组,分为15组:模型组,氢化可的松组,阿司匹林组,金铃子散低、中、高剂量组,痛泻要方低、中、高剂量组,芍药甘草汤低、中、高剂量组,柴郁汤低、中、高剂量组。第一天对小鼠称重,编号,分组,第一天下午模型组灌胃蒸馏水,氢化可的松组灌胃氢化可的松溶液,阿司匹林组灌胃阿司匹林混悬液,四种中药复方制剂低、中、高剂量组分别灌胃对应的低、中、高剂量的四种中药复方制剂。第二天至第五天灌胃给药,剂量同第一天,最后一次灌胃1h后,在小鼠右耳正反面均匀涂抹2%的巴豆油混合致炎剂50μl,左耳不做任何处理。4h后,测定小鼠右耳肿胀度。实验三观察四种中药复方制剂对1%角叉菜胶引起的大鼠气囊炎性液中炎性介质的抑制作用:清洁级wistar大鼠150只,按体重进行随机区组分组,分为15组:正常组,模型组,金铃子散低、中、高剂量组,痛泻要方低、中、高剂量组,芍药甘草汤低、中、高剂量组,柴郁汤低、中、高剂量组和氢化可的松组。第一天对大鼠称重,编号,分组,第二天、第三天用剃毛器给大鼠背部剃毛,第三天背部皮下注射空气20 ml(事先经0.2μm过滤器滤过),制作气囊。第四天早上正常组灌胃蒸馏水,模型组灌胃蒸馏水,氢化可的松组灌胃氢化可的松溶液,四种中药复方制剂低、中、高剂量组分别灌胃对应的低、中、高剂量的四种中药复方制剂,第五天、第八天分别给大鼠背部皮下再次注射10ml的空气以维持气囊的膨胀,第五天至第九天灌胃给药,剂量同第四天,第九天灌胃给药后1h,向大鼠气囊内注入1%角叉菜胶溶液每只2ml,正常组除外。6h后腹腔静脉采血和从气囊中取炎性渗出液。测定血清皮质醇含量,测定炎性渗出液中前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、一氧化氮(nitric oxide,NO)、白细胞介素-6(interleukin,IL-6)的含量。实验四探讨四种中药复方制备的药物血清对中性多形核白细胞的抑制作用:将1%的角叉菜胶混悬液1ml通过肋骨间隙注入大鼠右侧胸腔内4h后,处死动物,用冷盐水5ml两次冲洗胸腔,收集PMNs,一部分作白细胞计数,900g,5min离心后,弃上清液,加入冷的0.87%氯化铵溶液5ml,使红细胞溶解,剩下的均为PMNs。用磷酸盐缓冲液PBS洗两次,悬浮细胞,用台盼蓝拒染法做活力测定,活细胞超过95%,用RPIM1640培养基培养过夜,用RPMI1640洗细胞两次,1500r/min离心,每10 ml细胞悬液中加入200μl谷氨酰胺,以调细胞浓度至3.5×105/ml。将3.5×105/ml多形核白细胞接种于2块96孔培养板中,每孔100μl,同时设RPMI1640培养液对照组,不加PMNs,只加RPMI1640培养液150μl(空白组),分别设四种中药复方制备的药物血清组,金铃子散高剂量组(金铃子散组),痛泻要方高剂量组(痛泻方组),芍药甘草汤高剂量组(芍甘汤组),柴郁汤高剂量组(柴郁汤组),正常大鼠血清组(正常组),PBS组,延胡索乙素标准品低剂量组(延胡索乙素低组),延胡索乙素标准品中剂量组(延胡索乙素中组),延胡索乙素标准品高剂量组(延胡索乙素高组),芍药苷标准品低剂量组(芍药苷低组),芍药苷标准品中剂量组(芍药苷中组),芍药苷标准品高剂量组(芍药苷高组),姜黄素标准品低剂量组(姜黄素低组),姜黄素标准品中剂量组(姜黄素中组),姜黄素标准品高剂量组(姜黄素高组),氢化可的松组。每孔中均加入药物血清或PBS或标准品溶液50μl。37℃、5%CO2孵育箱中预培养24h。测定时,向每孔中加入20μlluminol发光剂,最后每孔中加入150μl酵母多糖应用液置入发光测定仪,测其发光强度。结果:实验一四种中药复方制剂在角叉菜胶引起足肿胀4h时抑制作用最强。实验二低、中、高剂量的金铃子散与中、高剂量的芍药甘草汤均能明显抑制巴豆油混合致炎剂起的小鼠耳肿胀,而痛泻要方和柴郁汤对耳肿胀的抑制作用较弱。实验三金铃子散和芍药甘草汤对大鼠气囊炎性液中PGE2有显著抑制作用。金铃子散、痛泻要方、芍药甘草汤和柴郁汤对大鼠气囊炎性液中白细胞介素-6有显著抑制作用。金铃子散、痛泻要方、芍药甘草汤和柴郁汤对大鼠气囊炎性液中一氧化氮有明显抑制作用。实验四金铃子散药物血清、痛泻要方药物血清、芍药甘草汤药物血清、延胡索乙素(10-5-10-3mol/L)、芍药苷(10-5-10-3mol/L)和姜黄素(10-5-10-3mol/L)对中性多形核白细胞具有显著抑制作用。结论:1.金铃子散、痛泻要方、芍药甘草汤和柴郁汤在体内外均有明显的抗炎作用。2.金铃子散、痛泻要方、芍药甘草汤对足肿胀的作用与氢化可的松相似;对耳肿胀的作用与阿司匹林相似。3.其抗炎作用机制部分在于抑制PGE2、NO、IL-6的产生。对PGE2、NO、IL-6的影响与氢化可的松相似。4.芍药甘草汤的作用机制可能还在于影响下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴。
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