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重症肌无力(Myasthenia Gravis,MG)是一种累及神经肌肉接头突触后膜上乙酰胆碱受体的自身免疫性疾病,主要表现为骨骼肌无力、易疲劳,由于其反复发病、经久不愈,给患者带来巨大痛苦和严重经济负担。MG自身抗体来源及自身免疫反应始发部位至今尚未完全明了。有证据显示MG与胸腺异常密切相关,80%-90%MG患者胸腺有病理学异常,其中65%-75%为胸腺淋巴滤泡增生,10%伴有胸腺瘤。胸腺是中枢免疫器官,青春期后胸腺逐渐萎缩,最近认为成人萎缩的胸腺仍能够产生功能性T细胞。T细胞受体切除环(T cell receptor excision circle,TREC)是T细胞受体基因重排过程中的产物,外周血TREC水平能反映胸腺功能的变化。有报道用检测信号连接(signal joint,sj)TREC方法研究MG患者胸腺功能的变化以及胸腺切除对外周T细胞的影响,结果显示胸腺切除与未切除MG患者的外周血T细胞sjTREC水平无显著差异,但均显著低于正常人。由于该研究中MG患者接受过免疫抑制治疗,因此尚不能客观反映这一变化究竟是MG胸腺本身的变化还是免疫抑制药物对胸腺功能影响,目前尚未见更深入的研究报道。MG发病过程中除了体液免疫因素外,T细胞依赖机制也占有重要位置。CD4+ T、CD8+ T比例失调及相关细胞因子异常表达与诱发自身免疫反应、产生自身抗体有关。CD4+CD25+ T细胞是新近发现的一种调节性T细胞,参与维持外周免疫耐受,在自身免疫病的预防和治疗中有很好的应用前景,目前尚不清楚它在MG中的意义。胸腺切除是治疗MG的重要方法,多数患者术后病情明显缓解,远期疗效更好,但其确切机制仍不清楚。MG也是临床上唯一通过切除胸腺治疗的疾病,深入研究MG胸腺功能变化、以及胸腺切除后机体免疫功能变化,探讨胸腺切除治疗MG的免疫学机制,为胸腺切除治疗MG提供理论参考。基于对上述研究现状的认识,本课题从以下几个方面进行研究:1、通过应用电子显微镜、免疫组织化学、流式细胞术,观察MG胸腺的病理改变、血管周围间隙和胸腺细胞亚群变化。2、构建载有sjTREC-RAG2基因片段的质粒载体;应用实时荧光定量PCR方法检测胸腺切除与未切除MG患者外周血sjTREC。3、检测胸腺切除与未<WP=13>切除MG患者外周血CD4+/CD8+ T细胞亚群及相关细胞因子IL-4和IFN-γ、CD4+CD25+ 调节性T细胞、免疫球蛋白、补体、AChR抗体水平的变化。随访胸腺切除MG患者,观察其临床疗效及有无合并其它自身免疫性疾病。实验结果显示:1、MG胸腺存在病理学异常。9-20岁、21-45岁MG胸腺的血管周围间隙百分比(29.90±6.95、52.57±12.97)较同龄对照组胸腺(21.00±3.41、35.86±13.58)显著增加(P<0.05、P<0.05),46-55岁MG胸腺与同龄对照组无显著差异(P>0.05)。 2、 9-20岁MG胸腺中CD4+CD8+双阳性胸腺细胞占胸腺细胞百分比(72.70±6.34)较同龄对照组胸腺(85.30±4.04)显著降低(P<0.01),21-45岁、46-55岁MG胸腺与同龄对照组无显著差异(P>0.05、P>0.05)。3、构建并获得载有sjTREC- RAG2基因片段的pMD 18-T 质粒,可以作为实时荧光定量PCR技术检测sjTREC的标准品。4、正常对照组、胸腺切除与胸腺未切除MG患者外周血sjTREC水平均与年龄呈显著负相关(P<0.01、P<0.01、P<0.01)。 5、9-20岁胸腺未切除MG患者外周sjTREC水平(112.00±16.89个/104个T细胞)非常显著低于同龄对照组(173.10±14.78个/104个T细胞)(P<0.01),但显著高于胸腺切除MG患者(97.27±11.88个/104个T细胞)(P<0.05)。21-45岁、46-55岁胸腺切除MG患者与同龄胸腺未切除MG患者、对照组之间均无显著差异(P >0.05)。 6、胸腺未切除MG患者外周血CD8+T%(31.09±7.54)非常显著低于对照组(37.38±3.28)(P<0.01),CD4+/CD8+非常显著增高(P<0.01);胸腺切除MG患者CD8+T%、CD4+/CD8+与对照组无显著差异(P>0.05、P>0.05)。胸腺未切除MG患者外周血CD4+CD25+ T%(13.56±1.29)非常显著低于对照组(18.04±1.35)(P<0.01);胸腺切除MG患者外周血CD4+CD25+ T%(16.87±1.50)非常显著高于胸腺未切除MG患者(P<0.01),但仍非常显著低于对照组(P<0.01)。7、胸腺未切除MG患者外周血IFN-γ水平(147.00±46.65 pg/ml)非常显著高于对照组(66.48±10.65 pg/ml)(P<0.01);胸腺切除MG患者外周血IFN-γ水平(89.72±29.46 pg/ml)非常显著低于胸腺未切除MG患者(P<0.01),但仍非常显著高于对照组(P<0.01)。8、随访胸腺切除MG患者,完全缓解率36%,部分缓解率52%,未发现新合并其它自身免疫性疾病。全文结论如下:1、MG胸腺存在病理学异常。MG胸腺退化加快,PVS比例增加,胸腺实质萎缩伴CD4+CD8+胸腺细胞减少。2、用载有sjTREC-RAG2基因的pMD 18-T 质粒做标准品能够精确计算出样品中sjTREC数量。3、正常人外周血sjTREC 水平与年龄呈负相关,随着年龄增加sjTREC水平逐渐下降。MG患者外周血sjTREC水平较正常人显著降低,胸腺切除后虽年轻组有所下降,中老年则无变化。MG疾病本身是<WP=14>引起胸腺功能降低的主要因素,说明保留MG胸腺在T细胞免疫重建中已无意义。4、MG患者的细胞免疫及体液免疫异常在胸腺切除后不仅没有加重,反而有一定程度的改善,胸腺切除是治疗MG安全、有效的方法。MG患者胸腺切除后临床疗效与CD4+CD25+T细胞数量增加有关。5、MG发病和持续与外周血IFN-γ水平有密切关系,而与IL-4水平关系?