Halomonas sp.XH26菌株紫外诱种及Ectoine高效积聚基因簇分子差异分析

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目的通过紫外线诱变小柴旦盐湖盐单胞菌Halomonas sp.XH26菌株,以获得高产Ectoine的突变株,为工程生产Ectoine提供优良的发酵菌源。方法以小柴旦盐湖盐单胞菌Halomonas sp.XH26为研究对象,采用形态学观察、生理生化试验及16S rRNA基因测序分析明确该菌株的分类地位。通过紫外线诱变甄选获得高产Ectoine的突变株。紫外诱变筛选Ectoine产量超过原始菌株2倍以上的正向突变菌株,HPLC测定胞内Ectoine产量,并对突变株进行连续培养,研究Ectoine的产量稳定性。通过形态学比较,生理生化鉴定、营养成分需求量比较以及Ectoine合成基因分子差异分析,初步探究突变菌Ectoine产量激增的分子机制。结果原始菌株XH26(Ectoine优化产量456.82±15.72 mg/L,CDW 0.71±0.04g/L),经9轮紫外循环诱变处理后(50 s为最佳诱变时间),筛选获得7株高产Ectoine突变菌,Ectoine产量均大幅提高(约200%)。其中,积聚量最大的菌株HU09-32,产量可达1351.09±17.69 mg/L(增幅290%),将7株突变菌连续培养40天(接种2天/次),胞内Ectoine产量稳定,生长特性、增殖速度与积聚量明显优于原始菌株XH26,具有很好的发酵生产和工业应用潜力。通过单因素分析确定突变菌株的最优发酵条件。在优化后的发酵条件下,结合单因素实验、Plackett-Buman实验及响应面法,确定最优发酵培养基方案为:Na+1.42mol/L,K+0.5 mol/L,L-谷氨酸钠0.039 mol/L,酶水解酪素为19.7 g/L,Mg SO4.7H2O 0.10 mol/L,柠檬酸钠0.012 mol/L,Ca Cl2 0.2 g/L和酵母抽提物2.0 g/L。经模型验证实验,得到的突变菌株Ectoine的实际产量为1615.94 mg/L,细胞干重为0.73 g/L,与响应面实验分析预测的Ectoine产量基本一致,经培养基优化后Ectoine的产量提高了19.70%。结论通过电镜观察,发现突变菌HU09-32较XH26菌株菌体长度明显变短;并且不能利用肌醇、乳糖、鼠李糖、可溶性淀粉及D-半乳糖;对KCl、L-谷氨酸钠及酶水解酪素的需求量明显增加;在Ectoine积聚量方面,表现出较好的持续合成能力。经NCBI BLAST比对XH26菌株与突变菌株ect ABC基因相似度均为100%,说明Ectoine合成基因片段无差别,初步分析与Ectoine产量的提高无关联。
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