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耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurance)作为耐辐射微生物的代表,具有对电离(γ射线)和紫外(UV)辐射、氧化、干燥等胁迫以及其他DNA损伤试剂的极端抗性。研究发现,该菌中的IrrE蛋白(亦作PprI,DR0167)能显著增强DNA修复系统中的关键酶RecA和PprA的表达,并参与了辐射应答过程中的信号传导,被认为是辐射应答的总开关。IrrE蛋白具有较高的保守性,仅在该属菌株中发现其同源物,这些同源物在功能上互补。IrrE蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)中的异源表达能显著提高宿主菌对辐射、氧化、高盐、高温和高渗等逆境胁迫的耐受能力,并赋予转基因油菜对盐胁迫的抗性。本论文是在前期的研究基础上,开展IrrE蛋白增强大肠杆菌耐盐能力的研究,探讨该蛋白提高宿主菌的渗透胁迫抗性的机制,为irrE基因将来在转基因植物的应用中提供理论依据。本试验利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography)和原子吸收光谱法(atomic absorption spectrometry)测定在盐胁迫条件下IrrE表达的大肠杆菌细胞中渗透保护物含量,结果表明IrrE蛋白在大肠杆菌中异源表达后,显著提高了宿主菌在盐胁迫条件下海藻糖和甘油等渗透保护物的含量,而其他渗透保护物,如钾离子和甜菜碱的含量并无显著变化。利用实时荧光定量PCR的方法分析了与渗透相关的功能基因和调控基因的转录水平变化,其结果表明,在正常条件下和盐冲击条件下编码海藻糖合成酶的基因——otsA和otsB均高水平表达,而海藻糖降解基因treB和treC的表达水平显著下降,甘油降解相关基因的表达水平也有下降。同时,我们对耐酸相关基因、卷曲纤毛(curli)合成基因以及与胁迫调控因子RpoS代谢相关基因表达的分析发现,在大肠杆菌中这些基因的转录水平发生了显著的变化,暗示IrrE蛋白可能具有多方面的调控作用。RNA聚合酶的主要识别因子RpoS作为胁迫反应的调控因子,其基因表达水平增加,推测IrrE通过RpoS介导的胁迫应答在提高细胞胁迫抗性中发挥着重要的作用。RpoS控制了大肠杆菌大约10%的基因表达,其中许多为抗逆相关基因。为进一步研究IrrE蛋白及大肠杆菌胁迫调控因子RpoS在增强宿主菌株盐胁迫抗性中的作用。我们首先用western blot实验证实IrrE蛋白在大肠杆菌rpoS突变株中表达,然后非生物胁迫实验表明,IrrE没有显著提高rpoS突变株在高温、氧化和盐胁迫等逆境下的生存率;转irrE基因的rpoS突变株与转空载体的rpoS突变株含盐条件下的生存曲线也没有显著的差异;Biolog试验同样表明这两株菌的代谢图谱没有发生显著的变化。这些结果表明环境胁迫调控因子RpoS在耐辐射全局调控蛋白IrrE增强大肠杆菌逆境胁迫抗性的过程中具有重要的作用。但有关IrrE与RpoS的相互作用以及具体的作用机制仍需进一步的研究。本试验的结果将为进一步探讨和揭示IrrE的调控机制提供理论基础和研究思路。