论文部分内容阅读
目的： 肺癌是当今世界上发病率最高的恶性肿瘤之一，转移是造成患者死亡的重要原因。目前认为，上皮来源的恶性肿瘤在转移早期经历了上皮间质转化，使细胞间粘附能力降低及细胞侵袭及迁移能力增强。课题组前期研究发现，DAL-1可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和上皮间质转化，并通过免疫共沉淀及共聚焦实验发现DAL-1可与HSPA5相互结合且主要定位于细胞核外。本实验拟在前期工作的基础上，利用生物信息学分析DAL-1和HSPA5在肺癌组织中表达的相关性，预测两者参与的生物学过程及信号通路，并利用体外实验研究DAL-1对HSPA5的调控及机制，同时探讨DAL-1通过HSPA5对肺癌细胞生物学行为的影响，为研究肺癌的发生、发展及转移机制打下基础。 方法： 1.DAL-1和HSPA5在非小细胞肺癌中表达相关性分析 1.1 生物信息学分析DAL-1和HSPA5在非小细胞肺癌组织的表达相关性 在GEO数据库中，筛选含有肺癌分型及DAL-1和HSPA5的mRNA表达水平的非小细胞肺癌人体标本的GEO基因芯片；Spearman相关分析DAL-1和HSPA5在肺癌组织中表达的相关性； 1.2 构建细胞稳定株，体外实验观察DAL-1对HSPA5表达的调控作用 以16HBE为对照，Western blot检测非小细胞肺癌细胞系H1975、A549、H1299、SPC-A1、H460和H520细胞中DAL-1和HSPA5蛋白表达水平。利用过表达DAL-1的慢病毒及对照病毒感染A549细胞，QPCR和Western blot实验检测细胞株中DAL-1和HSPA5的表达水平。 2.DAL-1对HSPA5在非小细胞肺癌细胞的调控机制 2.1 DAL-1在转录水平对HSPA5的调节作用 利用UCSC等数据库预测HSPA5启动子序列，采用基因克隆手段在人全血DNA中截取HSPA5启动子区域，构建含有HSPA5启动子截短片段-1953至+382bp、-1433至+382bp、-943至+382bp、-444至+382bp、-401至+382bp、-364至+382bp、-236至+382bp、-131至+382bp、-24至+382bp的HSPA5启动子的双荧光素酶报告基因载体pGL-HSPA5-promoter。脂质体介导pGL-HSPA5-promoter+pRL-TK+pcDNA3-DAL-1（实验组）和pGL-HSPA5-promoter+pRL-TK+pcDNA3（对照组）质粒瞬时转染至肺癌A549细胞中，双荧光素酶报告基因实验检测DAL-1对HSPA5启动子转录活性的影响。 2.2 DAL-1在蛋白水平对HSPA5的调节作用 DAL-1对HSPA5蛋白稳定性的影响：实验分为四组：A549+DC+DMSO细胞（对照组），过表达DAL-1的A549+DAL-1+DMSO细胞（实验组1），加入蛋白合成酶抑制剂放线素酮(cycloheximide,CHX,30uM)的A549+DC+CHX细胞（实验组2），以及过表达DAL-1后加入CHX的A549+DAL-1+CHX细胞（实验组3）。在提取蛋白前6小时将CHX加入相应细胞中，Western blot检测HSPA5蛋白表达水平。DAL-1对HSPA5蛋白降解途径的影响：实验分为四组：A549+DC+DMSO细胞（对照组），过表达DAL-1的A549+DAL-1+DMSO细胞（实验组1），加入蛋白酶体抑制剂MG132(30uM)的A549+DC+MG132细胞（实验组2），以及过表达DAL-1后加入MG132的A549+DAL-1+MG132细胞（实验组3）。在提取蛋白前8小时将MG132加入相应细胞中，Western blot检测HSPA5的蛋白水平。 3.DAL-1通过HSPA5对非小细胞肺癌细胞EMT和细胞侵袭迁移的影响 3.1 HSPA5对细胞EMT和细胞侵袭迁移的影响 实验分为四组：过表达HSPA5的A549+HSPA5细胞（实验组1），干扰HSPA5的A549+siHSPA5细胞（实验组2）及对照A549+HSPA5control细胞（对照组1），A549+siHSPA5control细胞（对照组2）。Western blot方法检测HSPA5对E-cadherin、β-catenin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平的影响；Transwell侵袭和迁移实验、细胞划痕实验检测HSPA5对细胞侵袭迁移的影响。 3.2 DAL-1通过HSPA5对细胞EMT和细胞侵袭迁移的影响 实验分为四组：A549+DAL-1+HSPA5control（对照组1）、A549+DAL-1+siHSPA5control（对照组2）、A549+DAL-1+HSPA5（实验组1）、A549+DAL-1+siHSPA5（实验组2）。利用Western blot方法检测上述各组细胞中E-cadherin、β-catenin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平；Transwell侵袭和迁移实验、细胞划痕实验检测各组细胞侵袭迁移能力。 4.DAL-1通过HSPA5对非小细胞肺癌细胞增殖及细胞周期分布的影响 4.1 DAL-1对非小细胞肺癌细胞增殖及细胞周期分布的影响 实验分为两组：A549+DAL-1（实验组）和A549+DAL-1control（对照组），利用Western blot方法检测各组中C-Jun、C-Myc、CDK2、CCND3、p27、p21蛋白表达水平；CCK-8细胞增殖实验、流式细胞周期实验检测各组中细胞体外增殖和周期分布。 4.2 HSPA5对非小细胞肺癌细胞增殖及细胞周期分布的影响 实验分为四组：A549+HSPA5细胞（实验组1），A549+siHSPA5细胞（实验组2）及对照A549+HSPA5control细胞（对照组1），A549+siHSPA5control细胞（对照组2）。利用Western blot方法检测各组中C-Jun、C-Myc、CDK2、CCND3、p27、p21蛋白表达水平；CCK-8细胞增殖实验、流式细胞周期实验检测各组中细胞体外增殖和周期分布。 4.3 DAL-1通过HSPA5对非小细胞肺癌细胞增殖及细胞周期分布的影响 实验分为四组：A549+DAL-1+HSPA5control（对照组1）、A549+DAL-1+siHSPA5control（对照组2）、A549+DAL-1+HSPA5（实验组1）、A549+DAL-1+siHSPA5（实验组2）。利用Western blot方法检测各组中C-Jun、C-Myc、CDK2、CCND3、p27、p21蛋白表达水平；CCK-8细胞增殖实验、流式细胞周期实验检测各组中细胞体外增殖和周期分布。 5.DAL-1通过HSPA5-PI3K-AKT对非小细胞肺癌细胞EMT、增殖及侵袭迁移的影响 5.1 DAL-1和HSPA5相关基因富集分析 利用Linkedomics工具进行KEGG分析，通过基因富集预测DAL-1和HSPA5共同参与的生物学功能及信号通路。 5.2 DAL-1对PI3K-AKT通路蛋白表达水平的影响 实验分为两组：A549+DAL-1（实验组）和A549+DAL-1control（对照组），Western blot检测各组中PI3K-AKT通路蛋白表达水平。 5.3 HSPA5对PI3K-AKT通路蛋白表达水平的影响 实验分为四组：A549+HSPA5细胞（实验组1），A549+siHSPA5细胞（实验组2）及对照A549+HSPA5control细胞（对照组1），A549+siHSPA5control细胞（对照组2）。Western blot检测各组中PI3K-AKT通路蛋白表达水平。 5.4 DAL-1通过HSPA5对PI3K-AKT通路蛋白表达水平的影响 实验分为四组：A549+DAL-1+HSPA5control（对照组1）、A549+DAL-1+siHSPA5control（对照组2）、A549+DAL-1+HSPA5（实验组1）、A549+DAL-1+siHSPA5（实验组2）。Western blot检测各组中PI3K-AKT通路蛋白表达水平。 5.5 DAL-1通过PI3K-AKT对细胞EMT、增殖及侵袭迁移的影响 将PI3K抑制剂LY294002和AKT抑制剂MK2206分别加入A549+DAL-1细胞，建立A549+DAL-1+DMSO（对照组）、A549+DAL-1+LY294002（实验组1）和A549+DAL-1+MK2206（实验组2）。Western blot方法检测DAL-1通过PI3K-AKT对E-cadherin、β-catenin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平的影响；CCK8、Transwell侵袭和迁移实验、细胞划痕实验检测DAL-1通过PI3K-AKT对细胞增殖及增殖、侵袭迁移的影响。 5.6 HSPA5通过PI3K-AKT对细胞EMT、增殖及侵袭迁移的影响 将PI3K抑制剂LY294002和AKT抑制剂MK2206分别加入A549+HSPA5细胞，建立A549+HSPA5+DMSO（对照组）、A549+HSPA5+LY294002（实验组1）和A549+HSPA5+MK2206（实验组2）。Western blot方法检测HSPA5通过PI3K-AKT对E-cadherin、β-catenin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平的影响；Transwell侵袭和迁移实验、细胞划痕实验检测HSPA5通过PI3K-AKT对细胞增殖及侵袭和迁移的影响。 5.7 DAL-1通过HSPA5-PI3K-AKT对细胞EMT、增殖及侵袭迁移的影响 将PI3K抑制剂LY294002和AKT抑制剂MK2206分别加入A549+DAL-1+HSPA5细胞，建立A549+DAL-1+DMSO（对照组）A549+DAL-1+HSPA5+DMSO（实验组1）、A549+DAL-1+HSPA5+LY294002（实验组2）、A549+DAL-1+HSPA5+MK2206（实验组3）。Western blot方法检测DAL-1通过HSPA5-PI3K-AKT对E-cadherin、β-catenin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平的影响；CCK8、Transwell侵袭和迁移实验、细胞划痕实验检测DAL-1通过HSPA5-PI3K-AKT对细胞增殖及侵袭迁移的影响。 结果： 1.DAL-1在非小细胞肺癌细胞中下调HSPA5的mRNA及蛋白表达水平 1.1 生物信息学分析DAL-1和HSPA5在非小细胞肺癌组织中的表达呈负相关性 在GEO数据库中，最终挑选GSE43580和GSE33532芯片用于统计。 结果：显示，GSE44580芯片中两者在非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌组织中的表达水平呈负相关，在GSE33532芯片中，两者在非小细胞肺癌、肺鳞癌组织中的表达水平呈负相关，肺腺癌中成负相关趋势(p＜0.05)。 1.2 DAL-1在非小细胞肺癌细胞中下调HSPA5蛋白表达水平 细胞系蛋白表达水平检测结果显示，DAL-1在H1975、A549、H1299、SPC-A1细胞表达显著下调，在H460和H520细胞中显著上调。HSPA5在上述细胞中表达显著上调(p＜0.05)。DAL-1对HSPA5表达水平影响结果显示过表达DAL-1实验组中HSPA5的mRNA和蛋白水平下降(p＜0.05)。 2.DAL-1可与HSPA5启动子结合抑制其转录，同时促进HSPA5蛋白降解 2.1 DAL-1可与HSPA5启动子-444~-401片段结合下调HSPA5mRNA表达水平 成功预测和获取HSPA5启动子序列，并截取了HSPA5转录起始位点上游2000片段的启动子区域进行截短，成功构建质粒pGL3-HSPA5promoter。经双酶切证实插入片段的大小及方向均与设计的一致，测序结果与Genbank比对显示完全匹配。双荧光素酶显示转染DAL-1后荧光素酶活性较空载体组显著降低(p＜0.05)，但在共转染了含有-401~+382bp启动子片段的载体后，DAL-1对HSPA5启动子活性的的抑制作用消失，实验组与对照组的荧光素酶表达无显著差异。 2.2 DAL-1可促进HSPA5蛋白通过蛋白酶体途径降解 检测蛋白稳定性实验结果显示，与未加入CHX的A549+DAL-1细胞相比，加入了CHX的A549+DAL-1细胞HSPA5蛋白表达水平显著下调(p＜0.05)。检测蛋白降解途径实验结果显示，与未加入MG132的A549+DAL-1细胞相比，加入了MG132的A549+DAL-1细胞中HSPA5蛋白表达水平显著上调(p＜0.05)。 3.DAL-1下调HSPA5蛋白表达水平抑制细胞EMT的发生，进而抑制细胞侵袭迁移 3.1 HSPA5促进细胞EMT，进而促进细胞侵袭迁移 实验组1与对照组1相比，Vimentin、N-Cadherin蛋白表达水平显著上调，E-Cadhedrin、β-Catenin蛋白表达水平表达显著下调(p＜0.05)；迁移侵袭细胞数量明显增加，迁移速度加快(p＜0.05)。实验组2与对照组2相比，E-Cadhedrin、β-Catenin蛋白表达水平显著上调，Vimentin、N-Cadherin蛋白表达显著下调(p＜0.05)；迁移侵袭细胞数量明显减少，迁移速度减慢(p＜0.05)。 3.2 DAL-1下调HSPA5蛋白表达水平，抑制细胞EMT，进而抑制细胞侵袭迁移 实验组1与对照组1相比，Vimentin、N-Cadherin蛋白表达显著上调，E-Cadhedrin、β-Catenin蛋白表达水平显著下调(p＜0.05)，迁移侵袭细胞数量明显增加，迁移速度加快(p＜0.05)。实验组2与对照组2相比，Vimentin、N-Cadherin蛋白表达水平显著上调，E-Cadhedrin、β-Catenin蛋白表达水平显著下调，迁移侵袭细胞数量明显增加，迁移速度加快(p＜0.05)。 4.DAL-1下调HSPA5蛋白表达水平抑制细胞增殖 4.1 DAL-1抑制细胞增殖、细胞G1-S期周期分布 实验组与对照组相比，p27、p21蛋白表达水平显著上调，C-Jun、C-Myc、CDK2、CCND3蛋白表达显著下调(p＜0.05)；细胞周期G1细胞显著增加，S期细胞显著减少(p＜0.05)。 4.2 HSPA5促进抑制细胞增殖、细胞G1-S期周期分布 实验组1与对照组1相比，C-Jun、C-Myc、CDK2、CCND3蛋白表达水平显著上调，p27、p21蛋白表达水平表达显著下调(p＜0.05)；体外细胞增长速度显著加快(p＜0.05)；细胞周期G1细胞显著减少，S期细胞显著加快(p＜0.05)。实验组2与对照组2相比，p27、p21蛋白表达水平显著上调，C-Jun、C-Myc、CDK2、CCND3蛋白表达显著下调(p＜0.05)；体外细胞增长速度显著减慢(p＜0.05)；细胞周期G1细胞显著增加，S期细胞显著减少(p＜0.05)。 4.3 DAL-1下调HSPA5蛋白表达水平抑制细胞增殖 实验组1与对照组组1相比，C-Jun、p27蛋白表达水平显著上调(p＜0.05)，C-Myc、CDK2、CCND3、p21蛋白表达水平无显著差异，体外细胞增长速度显著加快(p＜0.05)，细胞周期无显著差异。实验组2与对照组2相比，C-Jun、CDK2蛋白表达水平显著下调(p＜0.05)，C-Myc、CCND3、p27、p21蛋白表达水平无显著差异，体外细胞增长速度显著加快(p＜0.05)，细胞周期G1细胞显著增加，S期细胞显著减少(p＜0.05)。 5.DAL-1可通过HSPA5-PI3K-AKT信号通路抑制细胞EMT，进而抑制细胞侵袭迁移 5.1 DAL-1和HSPA5在非小细胞肺腺癌中相关基因的富集分析 相关基因富集分析结果显示DAL-1和HSPA5共同参与Toll样受体信号通路，查找文献发现Toll样受体信号通路涉及PI3K-AKT、NF-κB、JAK-STAT等细胞信号通路的参与。 5.2 DAL-1可下调PI3K-AKT通路活性 实验组与对照组相比，p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平显著下调(p＜0.05)，但PI3K、AKT表达无显著差异。。 5.3 HSPA5可上调PI3K-AKT通路活性 实验组1与对照组1相比，p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平表达显著上调(p＜0.05)，但PI3K、AKT表达无显著差异。实验组2与对照组2相比，p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平显著下调(p＜0.05)，但PI3K、AKT表达无显著差异。 5.4 DAL-1可下调HSPA5蛋白表达水平抑制PI3K-AKT通路活性 实验组1与对照组1相比，p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平显著上调(p＜0.05)，但PI3K、AKT表达无显著差异。实验组2与对照组2相比，p-PI3K、p-AKT蛋白表达显著上调(p＜0.05)，但PI3K、AKT表达无显著差异。 5.5 DAL-1可通过PI3K-AKT通路抑制细胞EMT，进而抑制细胞侵袭迁移 实验组1和实验组2与对照组相比，两组结果均显示N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平显著上调，E-cadherin、β-catenin蛋白表达水平显著下调(p＜0.05)，体外细胞增长速度无显著差异，迁移侵袭细胞数量明显增加，细胞迁移速度明显加快(p＜0.05)。 5.6 HSPA5可通过PI3K-AKT通路抑制细胞EMT及增殖，进而抑制细胞侵袭迁移 实验组1、实验组2分别与对照组相比，两组结果均显示N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平显著下调(p＜0.05)，E-cadherin、β-catenin蛋白表达水平无显著差异，体外细胞增长速度显著减慢(p＜0.05)，迁移侵袭细胞数量明显减少，细胞迁移速度明显减慢(p＜0.05)。 5.7 DAL-1可通过HSPA5-PI3K-AKT通路抑制细胞EMT，进而抑制细胞侵袭迁移 实验组2和实验组3分别与实验组1相比，N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平显著上调(p＜0.05)，E-cadherin、β-catenin蛋白表达水平无显著差异，体外细胞增长速度无显著差异，迁移侵袭细胞数量明显减少，细胞迁移速度明显减慢(p＜0.05)。 结论： 1.DAL-1可与HSPA5启动子-444~-401片段结合，下调HSPA5mRNA表达水平，同时DAL-1可促进HSPA5蛋白通过蛋白酶体途径降解，下调HSPA5蛋白表达水平； 2.DAL-1可通过下调HSPA5的表达，抑制非小细胞肺癌细胞EMT及增殖的发生，进而抑制细胞侵袭迁移； 3.DAL-1可通过PI3K-AKT信号通路抑制细胞EMT的发生，进而抑制细胞侵袭迁移； 4.HSPA5可通过PI3K-AKT信号通路促进细胞EMT及增殖的发生，进而促进细胞侵袭迁移； 5.DAL-1可通过HSPA5-PI3K-AKT通路抑制非小细胞肺癌细胞EMT的发生，进而抑制肺癌的转移.