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目的通过密度梯度离心法获取大鼠骨髓血单核细胞,在体外诱导分化培养得到EPCs;购买沉默型pEGFP-shRNA-wnt3a重组质粒,将其转染入EPCs,检测其在EPCs中的表达,并利用MTT法检测EPCs的增殖能力变化,为进一步的研究提供了基础。方法①EPCs的分离、培养及鉴定:密度梯度离心法获取大鼠骨髓血单核细胞,于含10%FBS的EGM-2培养基中培养,并经免疫细胞化学CD133及VEGFR-2双抗体荧光检测和Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1荧光检测。②脂质体介导沉默型pEGFP-shRNA-wnt3a重组质粒转染EPCs并检测wnt3a蛋白表达变化:利用脂质体试剂LipofectamineTM 2000介导沉默型pEGFP-shRNA-wnt3a重组质粒转染EPCs,并设置空白对照组。转染48h后提取各组细胞总蛋白,Western blot法鉴定wnt3a蛋白在EPCs中的表达变化情况。③MTT法检测转染后EPCs的增殖活性:转染48h后消化收集EPCs,重悬并计数接种到96孔板中培养72h,MTT法分析转染后EPCs的增殖能力变化。结果①分离培养的细胞培养至第7天可观察到条索状特征,并经免疫细胞化学CD133及VEGFR-2双抗体荧光检测和Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1荧光检测均为阳性,证实培养的细胞为EPCs。②沉默型pEGFP-shRNA-wnt3a重组质粒转染EPCs 48h后,Western blot法鉴定wnt3a蛋白表达较空白对照组的EPCs明显降低。③MTT结果表明,与空白对照组相比,沉默型pEGFP-shRNA-wnt3a转染组中EPCs的体外增殖能力受到明显的抑制(0.364±0.014 vs 0.402±0.013,t=3.952,P<0.05)。结论通过密度梯度离心法于体外分离大鼠骨髓血成功培养出EPCs;沉默型pEGFP-shRNA-wnt3a重组质粒可有效沉默EPCs的wnt3a基因;沉默型pEGFP-shRNA-wnt3a重组质粒转染后明显抑制了EPCs的体外增殖能力。为进一步的研究提供了基础。