NMBR介导妊娠子宫平滑肌细胞中AP-1与NF-κB相互作用的研究

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目的:探索神经调节素B (Neuromedin B, NMB)—神经调节素B受体(Neuromedin B receptor, NMBR)作用的妊娠晚期人子宫下段平滑肌细胞内核转录因子(Nuclear factor kappa B, NF-κB)与激活蛋白-1(Activator protein1, AP-1)是否存在相互作用。方法:1.通过组织块培养法获得妊娠晚期人子宫平滑肌原代培养细胞,借助免疫细胞化学方法对细胞进行鉴定并检测细胞内NMBR表达。2.以10-6M、10-8M、10-10M浓度NMB分别诱导子宫平滑肌细胞48小时后,蛋白免疫印迹法(Western blotting, WB)检测AP-1与NF-κB蛋白在各组中的表达。分别使用anti-NF-κB p65抗体和anti-c-Jun抗体分别行免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, co-IP),后联合WB技术,正、反验证co-IP沉淀下来的复合物中分别存在AP-1和NF-κB蛋白。3.以NMB最佳诱导浓度分别诱导子宫平滑肌细胞12h、24h及48h。WB检测AP-1与NF-κB蛋白在各组中的表达,同理使用anti-NF-KB p65抗体和anti-c-Jun抗体分别行免疫共沉淀,正、反验证两蛋白间存在相互作用。结果:1.获得妊娠晚期人子宫下段平滑肌原代培养细胞,至少可以传5代,经α-SMA鉴定为高纯度子宫平滑肌细胞,且证实细胞内NMBR表达阳性。2.以10-6M、10-8M、10-10M浓度NMB诱导子宫平滑肌细胞48h后,anti-NF-κB p65抗体行免疫共沉淀,沉淀复合物以anti-c-Jun抗体作为一抗行WB鉴定,分子量36KD处出现条带;同理,经anti-c-Jun抗体富集下来的免疫共沉淀复合物,使用anti-NF-κB p65抗体作为一抗行WB鉴定,分子量65KD处出现条带。且于NMB诱导浓度为10-10M时,对应目的条带灰度值高于其它诱导浓度条带灰度值。3.以1010MNMB诱导子宫平滑肌细胞12h、24h及48h,正反验证anti-NF-κB p65/anti-c-Jun抗体富集下来的免疫共沉淀复合物,WB检测分子量36KD/65KD均有条带出现。且于NMB诱导时间为24h时,对应目的条带灰度值高于其它诱导时间条带灰度值。结论:NMB-NMBR作用的人妊娠晚期子宫下段平滑肌细胞中存在AP-1与NF-κB相互作用,且以10-1MNMB作用24h时,二者相互作用最强。
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