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前言：
近年来,脱发患者日益增多,它虽然不是致命性疾病,但给患者心理和日常生活交际带来的困扰是不可忽略的。临床上对于脱发的治疗历来都是医生所面对的棘手问题,并且疗效难尽人意。为克服这些困难,有学者提出毛囊细胞移植(follicularcellimplantation,FCI)治疗脱发,即通过将体外培养扩增的毛囊细胞植入脱发区来实现治疗目的。毛囊主要由表皮和真皮两种细胞成分组成,分别为上皮源性和间充质源性,两者通过相互间的信号传导调节着毛囊的形成、生长发育和周期性生长。其中,毛乳头细胞作为毛囊的真皮组分,在表皮和真皮的复杂信号联系中起着主导作用。故毛乳头细胞可以作为脱发细胞治疗的一个重要细胞来源,已有学者实验证实了将毛乳头细胞单独或联合其它毛囊相关细胞植入无毛区,可诱导毛囊和毛发的再生。
毛乳头在毛囊内的位置隐蔽,这给体外分离带来很多困难,目前主要有显微机械分离法、酶分法和采用流式细胞仪技术分离毛乳头细胞三种分离方法,各有利弊。
毛乳头细胞的鉴定可以通过其表达的一些特征性的分子实现,其中检测碱性磷酸酶活性最为普遍,它还可以作为毛乳头诱导毛发生长能力的评价指标,体内试验已证实了碱性磷酸酶与毛乳头细胞诱导毛发生长能力呈线性相关。
体外培养的毛乳头细胞生长缓慢,并且其毛发诱导能力也会随着传代次数增多而下降,这限制了毛囊细胞疗法的推广应用。因毛乳头的生长和诱导毛发生长的能力有赖于所处环境中各种分子的调控,故推测在体外培养体系中,外源补给这些因子或是增强它们的内源产生有助于促进毛乳头细胞的生长及其诱导毛发生长能力的保持。有学者提出骨形成蛋白(Bonemorphogeneticproteins,BMP)可以显著增加毛乳头细胞内碱性磷酸酶的表达,当敲除毛乳头细胞内的骨形成蛋白受体后,碱性磷酸酶的表达及毛乳头诱导毛发生长的能力均消失,说明骨形成蛋白对毛乳头的诱导毛发生长能力有促进作用。也有学者提出在培养体系内加入成纤维细胞生长因子-2(fibroblastgrowthfactorbasic,FGF-2)可抵消毛乳头细胞体外增殖缓慢的作用。
毛乳头细胞可分泌胰岛素样生长因子(Insulin-likegrowthfactor-1,IGF-1),它可促进毛囊上皮细胞的增生和迁移等,进而促进毛发的再生,因此在众多的促进毛发再生和生长的实验中,胰岛素样生长因子-1常被作为检测指标。
本研究以大鼠触须毛乳头细胞为研究对象,探讨骨形成蛋白-2和成纤维细胞生长因子-2单独及联合作用对毛乳头细胞增殖和毛发诱导能力的影响,以及骨形成蛋白-2是否通过胰岛素样生长因子-1促进毛发再生。
方法：
1、采用显微机械分离法对大鼠触须毛乳头进行分离,组织块培养法进行毛乳头细胞的原代培养。
2、以单克隆碱性磷酸酶抗体为一抗,对原代培养的毛乳头细胞进行免疫荧光鉴定,以空白对照和成纤维细胞组为对照。
3、骨形成蛋白-2与成纤维细胞生长因子-2单独及联合作用:
BMP-2组:细胞培养液内分别加入终浓度为0、50、100、200ng/ml的BMP-2;
FGF-2组:细胞培养液内分别加入终浓度为0、5、10、20ng/ml的FGF-2;
BMP-2和FGF-2联合组:实验组细胞培养液内加入100ng/mlBMP-2和10ng/ml;
FGF-2,对照组细胞培养液内无BMP-2和FGF-2。
4、采用CCK-8法检测毛乳头细胞增殖活性。
5、采用碱性磷酸酶活性测试盒检测毛乳头细胞的碱性磷酸酶活性。
6、毛乳头细胞分别被浓度为0、50、100、200ng/mlBMP-2作用后,采用酶联免疫吸附法检测细胞培养液内IGF-1的水平。
结果：
1、刚分离出的毛乳头呈梨形,毛乳头细胞的原代培养大约需要2周,细胞生长具有聚集性特征。
2、毛乳头细胞免疫荧光染色阳性,而空白对照组和成纤维细胞组的免疫荧光染色阴性。
3、毛乳头细胞增殖实验结果:
BMP-2组:BMP-2对毛乳头细胞的增殖无影响;
FGF-2组:FGF-2可以促进毛乳头细胞的增殖,且呈浓度依赖性;
BMP-2联合FGF-2组:BMP-2联合FGF-2可以促进毛乳头细胞增殖,且呈时间依赖性。
4、毛乳头细胞碱性磷酸酶活性检测实验结果:
BMP-2组:BMP-2增强毛乳头细胞碱性磷酸酶活性,且呈浓度依赖性;
FGF-2组:FGF-2减弱毛乳头细胞碱性磷酸酶活性,且呈浓度依赖性;
BMP-2联合FGF-2组:100ng/mlBMP-2联合10ng/mlFGF-2可以增强毛乳头细胞的碱性磷酸酶活性,且呈时间依赖性。
5、BMP-2可以增加毛乳头细胞培养上清液中IGF-1的水平,且呈浓度依赖性。
结论：
1、本次研究中,我们采用显微机械分离法成功分离了大鼠触须毛乳头,并经免疫荧光鉴定,体外培养毛乳头细胞体系成立。
2、与BMP-2或FGF-2单独作用相比,按适当浓度比例联合BMP-2和FGF-2,既可以促进毛乳头细胞的增殖,又可以保持其毛发诱导能力,故二者可形成互补关系,满足脱发细胞治疗的需要。
3、BMP-2可能通过促进毛乳头细胞分泌IGF-1,增强毛乳头细胞的毛发诱导能力,对BMP-2促进毛乳头细胞毛发诱导能力的机制起到了提示作用。
4、BMP-2可以同时增强毛乳头细胞的碱性磷酸酶活性和IGF-1的表达,它们都与毛乳头细胞的毛发诱导能力有关,故推测在毛发生长调节机制中,二者之间可能存在联系。