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干扰素(Interferon IFN)不仅具有抗病毒作用,它还具有抗肿瘤和免疫调节活性,并以多种不同途径影响细胞代谢、生长和分化。IFN分为Ⅰ型,Ⅱ型和Ⅲ型。而Ⅰ型干扰素包括的IFN-α至少有20种以上的亚型,它们已被用于治疗病毒性传染病和某些代谢性疾病或变态反应性疾病。毕赤酵母表达系统已被用于犬干扰素α1(Canine Interferon alpha Ca IFN-α1)的表达,在醇氧化酶启动子(Alcohol Oxidase 1 promoter,p AOX1)的紧密调控下,外源蛋白可在胞内表达或在α-因子分泌信号引导下表达在细胞外。酿酒酵母的α-因子分泌信号分为前后两区,前区负责信号识别,引导初生蛋白进入内质网并折叠,随后它被信号肽酶切掉,后区则负责将蛋白质从内质网转运到高尔基复合体,随后在KR位点被内切蛋白酶Kex2p切掉,最后2个EA重复序列被STE13基因产物修剪。应用酿酒酵母的α-因子作为分泌信号引导犬干扰素α1在毕赤酵母中的表达已在多篇文献中所见,但是,对α-分泌信号进行突变后对毕赤酵母表达Ca IFN-α1的影响尚未见到相关报道,本文比较了2种不同分泌信号的重组犬干扰素Ca IFN-α1在毕赤酵母中的分泌表达,以确认2种不同分泌信号表达载体的孰优孰劣。毕赤酵母表达载体p PIC9K含有AOX1启动子和酿酒酵母α-因子分泌信号,本实验室曾经构建过犬干扰素α1的表达载体p PIC9K-Ca IFN-α1,在分泌信号的引导下,犬干扰素α1在细胞外分泌表达。本次研究在p PIC9K-Ca IFN-α1的基础上,通过突变手段,将酿酒酵母α-因子分泌信号末端的EAEA(Glu-Ala-Glu-Ala)重复序列删除,并将构建好的表达载体命名为p PIC9K-mu MFα-Ca IFNα1。将p PIC9K-Ca IFNα1与p PIC9K-mu MFα-Ca IFNα1均用SalⅠ限制性内切酶线性化,在相同条件下,各自电转化入Pichia pastoris GS115中,并筛选出同等浓度G418压力下2种带有不同分泌信号的酵母菌株。随后通过BMGY/BMMY培养重组菌株并诱导其表达,表达产物通过Lowry法测定了总蛋白含量,通过犬干扰素α检测试剂盒对靶蛋白进行了定性定量,将带有酿酒酵母α-因子分泌信号的重组菌称为r GS115A,将携带删除EAEA重复序列的的α-分泌信号的重组菌称为r GS115B。蛋白质含量检测结果表明,r GS115A和r GS115B两者的总蛋白分泌水平相近,前者为131mg/m L,后者为136mg/m L,两者无显著性差别(P>0.05)。但是,犬干扰素α1在2种菌株中的表达量却明显不同,在r GS115B的表达量为92mg/L,占总蛋白的67.7%,而在r GS115A的表达量为78mg/L,占总蛋白的59.5%,前者表达水平明显高于后者,两者相差具有显著性(P<0.05)。本研究进一步比较了2种菌株表达产物的生物学活性,主要是抗病毒活性,但也对其免疫学活性(通过E-玫瑰花环试验测T淋巴细胞百分率)进行了初步分析,并通过SDS-PAGE测定了表达产物的分子量。通过SDS-PAGE,测得两种携带不同分泌信号的毕赤酵母表达菌株分泌的Ca IFN-α1分子量约为25k Da,这与其理论值18.5k Da不符,分析其原因,犬干扰素α1含有两个N端糖基化位点,推测酵母表达的犬干扰素α1发生了糖基化修饰。通过VSV-MDCK微量病变抑制法,测得两种菌株的分泌产物其抗病毒效价分别为2.58×107 u/mg(携带未突变分泌信号)和1.01×108 u/mg(携带突变分泌信号),后者的活性明显高于前者。通过E-玫瑰花环试验,测得两者均有促进犬外周血T淋巴细胞增殖的作用,但两者之间并无显著差别。综上所述,就本研究而言,删除EAEA重复序列的α-分泌信号引导的犬干扰素α1在毕赤酵母的分泌表达上,无论是其表达量还是其生物学活性,效果均明显高于携带未突变型α-分泌信号的重组犬干扰素α1毕赤酵母菌株。