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肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,严重危害人类的生命及健康,其发病机制迄今尚不完全明确。肺癌的早期临床症状轻微,多数患者在确诊时已属中晚期,因而造成了大量的术后转移和复发,在相当长的时间内寻找与肺癌侵袭转移的相关因子仍然是人类面临的亟需解决的重大问题。KISS1是Lee等在1997年利用修饰递减杂交技术在黑色素瘤细胞株中发现的一种肿瘤转移抑制基因,编码一个由145个氨基酸组成的亲水性蛋白,其氨基酸位点上存在着具有Src癌蛋白SH-3区特征的PXXP,可抑制带有SH-3的各种因子,参与转移级联反应抑制多种肿瘤的浸润、转移。 NF-κB是近年来发现的转录调控因子,转录因子NF-κB广泛存在于人的各种细胞中,调节从免疫系统、细胞生长到炎症等多个基因的表达,它的失调会导致包括肿瘤在内多种疾病的发生。NF-κB最常见的形式是由p50和p65组成的异源二聚体,NF-κB在细胞中与其阻抑物IκBα蛋白结合,以非活性形式存在于胞质中,当它被激活后,通过信号传导引起IκB的泛素化及蛋白酶体途径的降解,导致NF-κB-IκB复合物解体,解离的NF-κB进入到核内并暴露它的核识别位点,与特定靶基因结合而启动靶基因转录开放,调节多种基因的表达,在很多癌症中可以观察到NF-κB的异常,它通过转录调控激活一些与细胞增殖、血管新生、转移、肿瘤恶化、抑制细胞凋亡等有关基因的表达来参与肿瘤的发生和恶化过程。 基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinase,MMPs)是一类具有降解细胞外基质和基底膜能力的蛋白水解酶,在肿瘤细胞突破基底膜屏障而浸润、转移中起重要作用,在肿瘤演进等众多生理和病理过程中均发挥着重要的作用。研究发现,在许多肿瘤组织中,都发现有较高MMP9的表达,且其表达程度与肿瘤的侵袭性有关。 目前研究表明KISS1、NF-κBp65和MMP9在多种肿瘤组织中均存在异常表达,并证实与肿瘤的侵袭和转移过程存在密切关系,但目前对三者的研究多数是在各自独立的层面上,且三者之间的关系及相互作用机制至今尚未完全阐明,在肺癌中三者结合起来研究尚无文献报道。多种肿瘤细胞KISS1处于低表达状态,通过基因修饰可以增加KISS1蛋白的表达,肿瘤细胞中KISS1过表达若能激活NF-κB信号通路,封锁NF-κB的核内转移,减少其与MMP-9启动子的结合,进而使MMP9转录水平下降,MMP-9蛋白合成减少,籍以降低对Ⅳ型胶原及层粘连蛋白等成份的降解,减少对基底膜完整性的破坏,从而抑制肿瘤细胞侵袭转移,这也成为本课题立题的切入点所在。 本研究中,我们首先利用免疫组化技术、逆转录-PCR技术及免疫印迹技术测定人肺癌及癌旁组织中KISS1、NF-κBp65和MMP9mRNA及蛋白的表达情况及相互关系,旨在探讨三者在肺癌发生发展、侵袭和转移过程中的作用机制。随后利用基因扩增技术获得人KISS1基因cDNA序列,构建pEGFP-KISS1表达载体,并构建用于FRET实验的pECFP-KISS1及pEYFP-p65载体;将成功构建的pECFP-KISS1及pEYFP-p65载体转染到A549细胞中,利用激光共聚焦扫描显微镜进行基于感应发射法的FRET实验及全波段扫描FRET技术测定KISS1与NF-κBp65蛋白之间的相互作用;采用MTT实验、克隆形成实验、Transwell小室侵袭实验、逆转录-PCR技术及免疫印迹技术检测pEGFP-N1-KISS1载体转染后对KISS1、NF-κBp65和MMP9转录及翻译水平的调节及对肺癌细胞增殖能力、克隆形成能力、侵袭能力的影响。 本研究分为以下四个部分: 第一部分KISS1在肺癌组织中的表达及意义 方法: 1.免疫组化检测35例肺癌及癌旁组织中KISS1、NF-κBp65和MMP9蛋白的表达。 2.RT-PCR技术检测35例肺癌及癌旁组织中KISS1、NF-κBp65和MMP9mRNA的表达。 3.免疫印迹技术检测35例肺癌及癌旁组织中KISS1、NF-κBp65和MMP9蛋白的表达。 4.肺癌组织中KISS1、NF-κBp65和MMP9蛋白的相互关系。 结果: 1.免疫组化、逆转录PCR及免疫印迹结果显示KISS1在癌旁组织表达高于肺癌组织,差异有统计学意义(P<0.05);NF-κBp65、MMP9在肺癌组织中高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05); 2.KISS1和NF-κBp65、MMP9在肺癌组织中的表达呈负相关。 第二部分KISS过表达载体及FRET实验相关载体的构建 方法: 1.应用基因扩增技术获得人KISS1基因cDNA序列,经酶切、回收并连接到真核载体pEGFP-N1,构建pEGFP-KISS1载体, 2.应用基因扩增技术获得人KISS1及NF-κBp65基因cDNA序列,经酶切、回收并连接到真核载体pECFP-N1及pEYFP-C1,构建pECFP-KISS1及pEYFP-p65载体, 3.利用酶切法及测序法对pEGFP-N1-KISS1、pECFP-N1-KISS1及pEYFP-C1-p65载体进行鉴定。 结果: 1.成功克隆了人KISS1基因的全长cDNA,经测序后与GeneBank序列比对完全一致; 2.成功构建了pEGFP-N1-KISS1表达载体,酶切、测序鉴定正确; 3.成功构建了pECFP-N1-KISS1及pEYFP-C1-p65载体,经酶切、测序鉴定正确。 第三部分FRET技术检测A549细胞内KISS1蛋白与NF-kBp65蛋白的相互作用 方法: 1.将成功构建的pECFP-KISS1及pEYFP-p65载体转染到A549细胞中,利用荧光显微镜检测转染效率。 2.利用激光共聚焦扫描显微镜进行基于感应发射法的FRET实验。 3.采用全波段扫描FRET技术测定计算525nm/465nm荧光强度比值,测定KISS1与NF-κBp65蛋白之间的相互作用 结果: 1.pECFP-N1-KISS1及pEYFP-C1-p65转染效率分别为73.26%和81.43%; 2.共聚焦显微镜扫描结果显示A549细胞中KISS1与NF-κBp65蛋白有明显的FRET现象; 3.在共表达pECFP-N1-KISS1与pYFP-C1-p65的肺癌细胞中,525nm/465nm荧光强度的比值为(3.15±0.43),与对照组pEYFP-C1-p65+pECFP(0.59±0.13)和pECFP-N1-KISS1+pEYFP(0.67±0.18)相比,有明显差异(P<0.05),说明KISS1及NF-κBp65蛋白存在相互作用。 第四部分KISS1基因过表达对肺癌细胞生物学功能的影响 方法: 1.将KISS1过表达的载体转染到A549细胞,测定转染效率; 2.MTT法检测对照组、空载体组及KISS1组A549细胞增殖能力的变化。 3.克隆平板形成实验检测对照组、空载体组及KISS1组A549细胞克隆形成能力的变化。 4.Transwell小室侵袭实验检测对照组、空载体组及KISS1组细胞侵袭能力的变化。 5.逆转录-PCR法检测对照组、空载体组及KISS1组KISS1、NF-κBp65和MMP9mRNA含量。 6.免疫印迹法检测对照组、空载体组及KISS1组KISS1、NF-κBp65和MMP9蛋白的含量。 结果: 1.MTT法检测结果显示ALDH1A2过表达抑制A549细胞的增殖。 2.克隆形成实验显示ALDH1A2过表达降低了A549细胞克隆形成能力。 3.Transwell小室侵袭实验证实ALDH1A2过表达能够抑制A549细胞的侵袭能力。 4.RT-PCR及Wb检测结果显示:KISS1mRNA及蛋白含量在KISS1组显著高于对照组及空载体组,差异有统计学意义(P<0.05);NF-κBp65和MMP9mRNA及蛋白含量在KISS1组显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论: 1.人肺癌组织中KISS1表达低于癌旁组织,NF-κBp65和MMP9表达高于癌旁组织,KISS1和NF-κBp65、MMP9在肺癌组织中的表达呈负相关。 2.成功构建了pECFP-KISS1及pEYFP-p65载体,经酶切,测序鉴定正确。 3.成功构建并鉴定了KISS1基因过表达真核表达载体,并获得稳定过表达KISS1的A549细胞。 4.共聚焦显微镜扫描结果显示A549细胞中KISS1与NF-κBp65蛋白有明显的FRET现象; 5.KISS1过表达具有抑制肺癌细胞增殖、克隆形成、侵袭的作用,这种抑制作用可能于KISS1的过表达及NF-κBp65、MMP9的低表达相关。 6.KISS1可以通过调节NF-κBp65、MMP9的表达,抑制肺癌细胞生长、增殖、侵袭转移及粘附的作用。