【摘 要】
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目的研究Mex3c基因对胚胎神经管发育的影响及其可能的机制。方法（1）从NCBI数据库中分析Mex3c在各个组织中的表达,并利用原位杂交技术检测Mex3c在胚胎发育不同时期神经管中的表达水平。（2）通过Gen Bank、Ensembl数据库分析小鼠的Mex3c基因定位及序列;利用CRISPR Design软件设计基因敲除靶点来构建Mex3c基因敲除小鼠;并通过PCR及基因组测序鉴定小鼠基因型。（3
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目的研究Mex3c基因对胚胎神经管发育的影响及其可能的机制。方法（1）从NCBI数据库中分析Mex3c在各个组织中的表达,并利用原位杂交技术检测Mex3c在胚胎发育不同时期神经管中的表达水平。（2）通过Gen Bank、Ensembl数据库分析小鼠的Mex3c基因定位及序列;利用CRISPR Design软件设计基因敲除靶点来构建Mex3c基因敲除小鼠;并通过PCR及基因组测序鉴定小鼠基因型。（3）将胚胎按照基因型随机分为3组:野生型组(Mex3c+/+,WT组),纯合子敲除组(Mex3c-/-,KO组),杂合子敲除组(Mex3c+/-),H＆E染色观察3组胚胎神经管的发育情况;免疫荧光、Tunel染色及Western Blot观察WT组及KO组的胚胎神经干细胞增殖及凋亡情况;利用透射电镜观察WT组及KO组神经管发育的超微结构。（4）提取WT组及KO组神经管的RNA,并完成c DNA文库的构建及Illumina测序,利用R.3.6.3对差异表达基因进行GO功能富集分析及KEGG信号通路富集分析;并通过RT-q PCR验证测序结果。结果（1）NCBI数据库分析显示:Mex3c基因在胚胎的中枢神经系统（胚胎的脑部）及生殖系统（睾丸、卵巢）中表达较高;原位杂交发现Mex3c基因在E12.5d主要表达于胚胎的脑部,在E14.5d主要表达于胚胎的脑部及脊髓部。（2）Gen Bank及Ensembl数据库分析结果显示:Mex3c基因位于小鼠18号染色体上,基因总大小为19.942 kb;经PCR及基因组测序鉴定,成功构建Mex3c基因敲除小鼠。（3）H＆E染色结果显示:在E12.5d、E13.5d,纯合子敲除组（KO组）、杂合子敲除组的胚胎神经管与野生型组的（WT组）无明显差异;而在E14.5d,KO组的胚胎神经管相比WT组的胚胎神经管发育迟缓,表型明显异常;因此,后续实验选择E14.5d的KO组及WT组胚胎神经管组织进行实验。免疫荧光结果显示:WT组PCNA的表达较高,而KO组PCNA的表达明显减少（P＜0.0001）。Tunel染色结果显示:KO组tunel阳性细胞数比WT组明显增多（P＜0.05）,Western Blot检测Bax/Bcl-2比值结果显示,KO组高于WT组（P＜0.01）。透射电镜结果显示:WT组及KO组胚胎神经管中神经元细胞突触前、后膜均清晰,但KO组突触间隙消失,有一定程度融合,神经管发育具有明显的缺陷;除此之外,我们发现在WT组,胚胎神经管的线粒体呈椭圆形,线粒体嵴形态正常,而KO组胚胎神经管的线粒体水肿,显示大量空泡,线粒体嵴断裂、模糊甚至消失,表现为变形、增大,结构明显异常。（4）RNA-seq分析结果显示:共获得377个差异基因,其中表达上调101个,表达下调276个。GO富集分析发现在生物学过程方面主要富集于:细胞外基质的组织、软骨发育、血管生成的负调控、透明质酸代谢过程、胞吐的正向调节。在分子功能方面主要富集于:细胞间隙、细胞表面、细胞外基质、血红蛋白、突触后膜的组成部分。在细胞组分方面主要富集于:钙离子结合、蛋白质二聚活动、细胞外基质结构成分、清道夫受体活动、氧运输活动。KEGG富集分析发现主要信号通路富集于:神经活性配体受体相互作用、ECM-受体相互作用、钙信号通路、轴突导向、TGF-β信号通路、Notch信号通路。RT-q PCR验证结果显示:神经活性配体受体相互作用信号通路中的Avpr1a、Drd1、Htr7、Sstr1、Oxtr、Gabra5基因的m RNA表达水平下调,结果与RNA-seq结果一致;TGF-β信号通路中的Dcn、Bmp5、Bmp6、Fndc1、Grem1基因的m RNA表达水平下调,结果与RNA-seq结果一致;Notch信号通路中的Dll3、Mfng、Helt、Hes5基因的m RNA表达水平上调,结果与RNA-seq结果一致。结论本研究揭示了Mex3c在胚胎神经管发育过程中的重要作用,可能通过神经活性配体受体相互作用、TGF-β、Notch等信号通路,参与调控NSCs的增殖及凋亡过程,进而影响神经管的发育。
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