GDF11通过YME1L介导的OPA1动态平衡提高间充质干细胞治疗心肌梗死疗效

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研究背景:急性心肌梗死是世界范围内死亡率最高、最危及生命的疾病之一。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是治疗心肌梗死最有前途的细胞类型之一,有临床前试验支持供体细胞越接近心脏表型修复心脏功能的疗效越好。然而,无论MSCs的来源如何,移植到心梗周边区的MSCs因心梗后恶劣环境而存活率很低,限制了MSCs在心梗治疗中的应用。转化生长因子11(growth differentiation factor 11,GDF11)是转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族中的一员,已被证实可以在缺血/再灌注模型中刺激血管祖细胞的增殖和血管生成,可通过调控线粒体生成或线粒体动力学参与骨骼肌细胞线粒体质量控制。而在心肌损伤治疗中GDF11是否可提高心脏来源的MSCs活性及治疗疗效有待进一步研究。线粒体完整性的维持在细胞抵抗凋亡中起着重要的作用,线粒体功能障碍导致分裂激活和融合失活。因此我们推测缺氧条件下GDF11可能通过维持线粒体动态稳定及完整性对MSCs起到抗凋亡保护作用。研究目的:在体内和体外模型中验证缺氧条件下GDF11是否通过改善线粒体形态和功能对MSCs起到保护作用并提高其治疗疗效,并进一步探索作用机制。研究方法及结果:第一部分:本研究通过构建C57BL/6J小鼠心肌梗死(Myocardiac Infarction,MI)模型,明确过表达GDF11的慢病毒感染的MSCs(MSCs LV-GDF11)对心脏保护作用的影响。心脏切片荧光染色GFP及心脏RT-PCR均显示,心梗后3天,与MSCs LV组相比,MSCs LV-GDF11组细胞存活率明显提高。心梗后28天进行心脏超声及天狼星红染色,发现两组均较对照DMEM组小鼠心功能提高和纤维化程度降低,且MSCs LV-GDF11组较MSCs LV组有明显缓解。心梗后28天检测CD31和α-SMA等新生血管指标发现MSCs LV-GDF11组较对照组血管新生明显增加。体外实验使用重组因子r GDF11预处理MSCs 24小时(MSCsr GDF11)或过表达GDF11后暴露于缺氧缺血清环境中48小时构建凋亡模型。TUNEL染色和Western Blot显示GDF11处理后的MSCs可明显降低凋亡率。此外,收集MSCs经r GDF11或过表达GDF11后的上清,处理HUVECs后发现管腔形成增多,H9C2的细胞凋亡减少。第二部分:透射电镜发现缺氧条件下MSCsr GDF11组线粒体呈细长的管状形态,线粒体嵴致密、规则,而对照组线粒体呈短小点状,线粒体嵴消失。而且,MSCsr GDF11组OCR检测的基础氧耗和最大氧耗增加,细胞ATP产能增加,TMRM检测的线粒体膜电位增加。同时发现MSCsr GDF11组中调控线粒体内膜融合与分裂的因子Optic atrophy1(OPA1)蛋白水平明显增加。OPA1分长亚型(L-OPA1)和短亚型(S-OPA1),两者功能截然相反,L-OPA1调控线粒体内膜融合,而S-OPA1调控线粒体内膜分裂。在我们的研究中,缺氧条件下GDF11处理的MSCs中L-OPA1明显增多,与电镜观察结果一致。通过si-RNA对细胞OPA1进行特异性基因沉默,证实了GDF11对MSCs的抗凋亡保护作用是依赖于OPA1的。第三部分:进一步分析调控OPA1的因子后我们发现,GDF11处理MSCs后,Smad2/3磷酸化激活,YME1L增加,对线粒体形态的维持具有重要作用。而当ALK5或Smad2/3被抑制,或si-RNA下调YME1L后,GDF11的抗凋亡作用被抑制,线粒体形态和功能不能被改善,L-OPA1不再增多。结论:GDF11可通过激活TGF-β-Smad2/3通路,上调YME1L表达后促进L-OPA1的聚集,促使线粒体融合而保护线粒体形态的完整及功能的维持,对MSCs起到抗凋亡保护作用,从而优化移植MSCs治疗心肌梗死的疗效。
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